彭 超，蘇會波，熊 強，李 凡，林海龍

(1.中糧集團營養(yǎng)健康研究院，北京102209； 2.國家能源生物液體燃料研發(fā)(實驗)中心，北京102209)

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絮凝劑對雨生紅球藻采收的影響

彭 超1,2，蘇會波1,2，熊 強1,2，李 凡1,2，林海龍1,2

(1.中糧集團營養(yǎng)健康研究院，北京102209； 2.國家能源生物液體燃料研發(fā)(實驗)中心，北京102209)

為了找到可以加速雨生紅球藻采收的絮凝劑，選用幾種常用的無機絮凝劑和生物絮凝劑對雨生紅球藻進行處理，研究不同絮凝劑對雨生紅球藻采收的影響。結(jié)果表明:聚合硫酸鐵(SPFC)是絮凝效果最好的無機絮凝劑。其最佳使用條件：添加SPFC的質(zhì)量濃度為1.5 g/L，絮凝時間為120 min，絮凝率達到90.0%。殼聚糖作為一種性狀優(yōu)良的生物絮凝劑也被應(yīng)用于本研究中，其最佳的使用條件：pH為4.0，分子量(Mw)為5.0×103，添加殼聚糖的質(zhì)量濃度為20 mg/L，絮凝率達到74.8%。另外，當SPFC和殼聚糖協(xié)同作用時，雨生紅球藻的絮凝率達到最大值(97.0%)，遠遠高于二者單獨使用時的絮凝率；也縮短了最大絮凝率的時間，僅為90 min，絮凝效果明顯提高。SPFC和殼聚糖復(fù)合使用可應(yīng)用于雨生紅球藻大規(guī)模生產(chǎn)的采收。

雨生紅球藻；蝦青素；絮凝；殼聚糖

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)是一種單細胞淡水綠藻，其生活史復(fù)雜多樣，它的生長過程主要包括營養(yǎng)細胞生長(綠色細胞)和蝦青素積累(紅色細胞)兩個階段。雨生紅球藻是迄今發(fā)現(xiàn)的蝦青素含量最高的生物，被譽為天然蝦青素的“濃縮品”[1-2]。目前，雨生紅球藻有著較高的綜合利用價值和廣闊的應(yīng)用前景，然而由于雨生紅球藻生長速度較慢、細胞密度較低(約1 g/L)、細胞個體小、微藻細胞與培養(yǎng)液之間的密度差異較小等因素，使得雨生紅球藻采收方法的選擇成為雨生紅球藻大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的一個技術(shù)難點。從綜合成本上考慮，雨生紅球藻的采收過程占整個雨生紅球藻藻粉生產(chǎn)成本的20%～30%，甚至更高。因此，亟待開發(fā)出高效、環(huán)境友好的采收方法，提高雨生紅球藻采收的效率和經(jīng)濟性，促進雨生紅球藻的產(chǎn)品開發(fā)和應(yīng)用[4-5]。

目前，關(guān)于微藻采收方法的研究工作主要集中在過濾法、氣浮法、離心法以及絮凝法等方面[9-10]。其中，過濾法和氣浮法主要依賴于藻種的特性，且過濾法涉及濾膜堵塞與污染等問題不能較好地被解決，導(dǎo)致其在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中很少應(yīng)用；離心法雖然普適性強，但是從較低密度的藻液中，特別是在開放培養(yǎng)方式中的藻液中收集微藻生物質(zhì)將會導(dǎo)致設(shè)備的能耗極高。絮凝法是利用微藻表面的負電荷與絮凝劑所帶有的正電荷相結(jié)合的原理，使微藻細胞絮凝形成小的聚集體，從而達到藻體采收的目的。與其他微藻采收方法相比較，絮凝法可應(yīng)用于微藻的大規(guī)模采收，其藻種適用范圍較廣，而且能耗相對較低，被認為是更經(jīng)濟可靠的微藻采收方法[11]。

常用的絮凝劑主要包括無機絮凝劑類和生物絮凝劑類這2大類。無機絮凝劑是工業(yè)應(yīng)用最多的一類絮凝劑，具有生產(chǎn)工藝成熟、絮凝效率高等特點，如：FeCl3、Al2(SO4)3、聚合氯化鋁、聚合硫酸鐵等都是工業(yè)上常用的無機絮凝劑。然而，添加無機絮凝劑處理微藻的時候，由于絮凝過程中金屬離子的引入將在一定程度上限制微藻的后續(xù)應(yīng)用[12-13]。生物絮凝劑是近年來發(fā)展起來的一類高效絮凝劑，其中，殼聚糖的應(yīng)用最廣泛。殼聚糖是一種天然的高分子化合物，近年來因其無毒、可降解等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于微藻的絮凝研究[14-16]。

本論文中,筆者主要考察不同絮凝劑對雨生紅球藻采收的影響，并對兩類絮凝劑的使用條件進行優(yōu)化，以確定其最佳使用條件。同時，筆者嘗試通過將這兩類絮凝劑進行復(fù)合添加來提高雨生紅球藻的采收率，以進一步降低雨生紅球藻的生產(chǎn)成本，減少無機絮凝劑的使用量和金屬離子在藻液中的殘留量，從而為雨生紅球藻的商業(yè)化應(yīng)用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種及絮凝劑

雨生紅球藻原始藻種(藻種編號為FACHB-875)從中國科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫購買，經(jīng)過一系列分離、純化等工作，獲得了1株性狀優(yōu)良的藻種，保存于中糧營養(yǎng)健康研究院生物技術(shù)中心，藻種編號為NHRI A753.1。

FeCl3、KAl(SO4)2·12H2O(明礬)、Al2(SO4)3、聚合氯化鋁(PAC)、聚合硫酸鐵(SPFC)和不同分子量的殼聚糖均來源于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

雨生紅球藻生長培養(yǎng)基(BBM培養(yǎng)基，g/L)：NaNO3250，K2HPO475，NaCl 25，MgSO4·7H2O 75，CaCl2·2H2O 25，KH2PO4175，維生素B10.001，生物素2.5×10-7，維生素B121.5×10-7，Na2EDTA 0.75，MnCl2·4H2O 0.041，ZnCl2·7H2O 0.005， Na2MoO4·2H2O 0.004，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.097，CoCl2·6H2O 0.002。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 雨生紅球藻培養(yǎng)方法

將配制好的BBM培養(yǎng)液分裝至1 000 mL搖瓶中，裝液量為100 mL，121 ℃滅菌30 min，冷卻后在無菌條件下接入5 mL處于對數(shù)生長期的雨生紅球藻細胞，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照強度2 000 lx，培養(yǎng)溫度25 ℃，光暗比12 h∶ 12 h，通氣進行培養(yǎng)。

1.3.2 無機絮凝劑對雨生紅球藻采收的影響

取30 mL待采收的藻液于50 mL錐形瓶中，測定初始吸光值(A680)。加入絮凝劑FeCl3(1.0 g/L)、KAl(SO4)2·12H2O(1.6 g/L)、Al2(SO4)3(1.4 g/L)、PAC(1.4 g/L)和SPFC(1.0 g/L)，速度由快至慢攪拌，直至絮凝劑完全溶解后，室溫靜置，定時取樣測定上清液A680，每組設(shè)2個平行。

1.3.3 生物絮凝劑(殼聚糖)對雨生紅球藻絮凝效果的影響

1)pH對雨生紅球藻絮凝效果的影響。取30 mL待采收的藻液于50 mL錐形瓶中，測定初始A680。以2 mol/L HCl和2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)藻液的pH至4.0、5.0、6.0、8.0、9.0和10.0，藻液初始pH為7.0，室溫靜置，定時取樣測定上清液A680，每組設(shè)2個平行。

2)殼聚糖分子量(Mw)大小對雨生紅球藻絮凝效果的影響。取30 mL待采收的藻液于50 mL錐形瓶中，測定初始A680。在預(yù)實驗基礎(chǔ)上，按15 mg/L的質(zhì)量濃度分別添加分子量5.0×103、5.0×104、1.0×105以及8.0×105的殼聚糖，同時設(shè)立對照組，速度由快至慢攪拌至殼聚糖完全溶解后，室溫靜置，定時取樣測定上清液A680，每組設(shè)2個平行。室溫靜置，定時取樣測定上清液A680，每組設(shè)2個平行。

1.3.4 殼聚糖添加濃度對雨生紅球藻絮凝效果的影響

取30 mL待采收的藻液于50 mL錐形瓶中，測定初始A680。加入不同濃度的殼聚糖，添加質(zhì)量濃度分別為10、20、30和40 mg/L，同時設(shè)立空白對照組，速度由快至慢攪拌至殼聚糖完全溶解后，室溫靜置，定時取樣測定上清液A680值，每組設(shè)2個平行。室溫靜置，定時取樣測定上清液A680，每組設(shè)2個平行。

1.3.5 正交優(yōu)化實驗

利用正交方法設(shè)計實驗，進行3因素4水平正交實驗，劑量(A)、分子量(B)和pH(C)。取30 mL待采收的藻液于50 mL錐形瓶中，測定初始A680。加入殼聚糖，調(diào)節(jié)pH，速度由快至慢攪拌至殼聚糖完全溶解后，室溫靜置，定時取樣測定上清液A680，每組設(shè)2個平行。

1.3.6 復(fù)合絮凝劑對雨生紅球藻絮凝效果的影響

取30 mL待采收的藻液于50 mL錐形瓶中，測定初始A680。加入3種不同的絮凝劑(SPFC、殼聚糖、SPFC+殼聚糖)，速度由快至慢攪拌，直至絮凝劑基本上溶解后，室溫靜置，定時取樣測定上清液A680值，每組設(shè)2個平行組。

1.4 分析檢測方法

1)藻液濃度。用紫外分光光度計在波長為680 nm處測定藻液濃度，用吸光度值A(chǔ)680表示雨生紅球藻藻液的濃度。

2)藻液絮凝率。待測藻液經(jīng)充分振蕩混勻后，測定藻液A680值，計算細胞濃度N0；加入絮凝劑后，靜置，按時取上清液，測定A680值，計算t時刻的細胞濃度Nt；則t時的細胞采收率計算見式(1)

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 無機絮凝劑種類對雨生紅球藻絮凝效果的影響

為了考察不同的無機絮凝劑在雨生紅球藻采收工藝中的應(yīng)用效果，本試驗選用5種常用的無機絮凝劑，包括FeCl3、KAl(SO4)2·12H2O、Al2(SO4)3、PAC及SPFC，考察添加不同無機絮凝劑對雨生紅球藻絮凝效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 無機絮凝劑對雨生紅球藻絮凝率的影響Fig.1 Effects of inorganic flocculants types on the flocculation efficiency of Haematococcus pluvialis

由圖1可知:添加5種不同絮凝劑應(yīng)用到雨生紅球藻采收的研究時，絮凝效率均遠遠高于空白對照組。當絮凝時間在120 min以內(nèi)時，所有試驗組的絮凝率都呈明顯上升趨勢；這是因為無機陽離子絮凝劑通過水解作用，生成帶正電的金屬離子，而藻液中的微藻細胞帶有負電荷，兩者發(fā)生電中和作用，使微藻表面的負電荷減弱，從而增強了微藻的絮凝效率；絮凝初期(0～60 min)，帶正電的金屬離子與帶負電的微藻細胞未完全接觸，因而金屬離子對絮凝率的影響并不大。而當絮凝時間超過60 min后，電中和作用比較完全，絮凝率在120 min左右時已達到最大。其中，添加Al2(SO4)3和SPFC為絮凝劑時，絮凝效果最優(yōu)，絮凝率分別達88.5%和87.8%，對照組在實驗結(jié)束時絮凝率為18.6%。

研究發(fā)現(xiàn)，當絮凝時間超過120 min的時候，添加PAC試驗組的絮凝率出現(xiàn)明顯的降低，可能是因為發(fā)生了微藻細胞的自融，部分微藻細胞碎片進入上層液體導(dǎo)致其OD值上升。除此之外，其他試驗組(包括空白對照組)的絮凝率緩慢變化或維持不變。分析原因，此階段的電中和作用已消失，絮凝劑的存在不會對微藻的絮凝起到顯著的促進作用，這個階段的微藻絮凝作用還是依靠微藻的理化特性自然沉降。

2.2 無機絮凝劑添加濃度對雨生紅球藻絮凝效果的影響

以上研究結(jié)果表明，當添加Al2(SO4)3和SPFC這兩種無機絮凝劑作為絮凝劑時，絮凝效率最高。為了進一步研究這兩種無機絮凝劑的最佳添加濃度，本實驗設(shè)計了5個不同的添加梯度(0.5、0.8、1.0、1.5和2.0 g/L)，絮凝時間為120 min，結(jié)果如圖2所示。

圖2 無機絮凝劑添加濃度對雨生紅球藻采收的影響Fig.2 Effects of inorganic flocculants concentration on the flocculation efficiency of Haematococcus pluvialis

由圖2可知：當這兩種無機絮凝劑(Al2(SO4)3和SPFC)的添加質(zhì)量濃度低于0.8 g/L時，絮凝率的變化較慢，但Al2(SO4)3的絮凝效率要高于SPFC。當添加質(zhì)量濃度高于0.8 g/L時，絮凝率均急劇上升，當質(zhì)量濃度達到1.5 g/L時，絮凝率達到最大值，其中添加SPFC試驗組的絮凝率達到90%左右，稍高于Al2(SO4)3試驗組的值(85.0%)。因此，選擇SPFC作為雨生紅球藻采收的絮凝劑使用時，其使用條件：添加質(zhì)量濃度為1.5 g/L，絮凝時間為120 min。

2.3 殼聚糖對雨生紅球藻絮凝率的影響

無機絮凝劑的殘留和毒性等安全問題，可能會使雨生紅球藻在食品工業(yè)的應(yīng)用受到一定的限制。殼聚糖是一種天然的絮凝劑，安全性高，它在食品工業(yè)中使用不受限制。殼聚糖是一種高分子線性多糖，因為其具有陽離子聚電解質(zhì)的性質(zhì)，故可通過靜電吸引和吸附架橋使懸浮于藻液中的細胞形成大的絮凝團而沉降。此外，殼聚糖具有無毒、可生物降解等優(yōu)點，目前被普遍認為是最為安全有效的微藻絮凝劑。因此，本研究選擇殼聚糖這種生物絮凝劑應(yīng)用到雨生紅球藻的采收研究，在提高絮凝效率和降低生產(chǎn)成本方面進行了一些初步的探索。

2.3.1 單因素考察結(jié)果

過往的研究結(jié)果表明，藻液的pH、殼聚糖的分子量和添加濃度這3個外部因素對殼聚糖在微藻絮凝研究方面應(yīng)用的影響比較顯著[15-16]。因此，本研究首先對這3個重要的影響因素(pH、分子量、添加濃度)進行了單因素考察。

圖3為不同藻液pH條件下的雨生紅球藻絮凝效率變化曲線。由圖3可知，藻液的pH控制在酸性(4.0、5.0和6.0)條件時，紅球藻的絮凝效率明顯高于藻液pH在中性和堿性條件(7.0、8.0、9.0和10.0)的絮凝效率。這可能因為當pH較低時，藻液呈酸性，帶有正電荷，與帶負電荷的藻細胞發(fā)生電中和作用，此時細胞發(fā)生 “脫穩(wěn)現(xiàn)象”，從而產(chǎn)生絮凝；而當pH較高時，藻液呈堿性，帶有負電荷，使得微藻表面的電負性增強，細胞之間相互排斥作用加大，難以聚集，因而絮凝率降低。相關(guān)研究表明，pH對膠體顆粒的表面電荷Z電位、絮凝劑的性質(zhì)以及絮凝作用有較大影響。一般情況下,陽離子型絮凝劑適合于在酸性和中性的環(huán)境下使用，陰離子型絮凝劑適合于在中性和堿性的環(huán)境下使用。因此,殼聚糖作為絮凝劑進行添加時，藻液的最佳pH控制在pH 4.0～6.0。

圖3 藻液初始pH對雨生紅球藻絮凝率的影響Fig.3 Effects of initial pH on flocculation efficiency of Haematococcus pluvialis

圖4為添加不同分子量的殼聚糖(添加濃質(zhì)量度均為15 mg/L)對雨生紅球藻絮凝率的影響。由圖4可知：添加低分子量(5.0×103和5.0×104)的殼聚糖作為絮凝劑，其絮凝效果明顯優(yōu)于對照組。然而，添加高分子量的殼聚糖(1.0×105和8.0×105)對雨生紅球藻絮凝率的提高效果并不顯著。并且，當添加分子量為8.0×105的殼聚糖時，絮凝率與空白對照試驗組一致，沒有起到任何絮凝效果。這可能是因為低分子量的殼聚糖聚合度較低，與高分子量殼聚糖相比較更容易在水中溶解，并與微藻細胞形成共絮凝體系。因此，添加分子量為5.0×103的殼聚糖，最利于雨生紅球藻的絮凝。

圖5為不同質(zhì)量濃度的殼聚糖(Mw=5.0×103)添加量對雨生紅球藻絮凝率的影響。由圖5可知：與空白對照組相比，殼聚糖的加入可顯著提高藻體的絮凝率。當殼聚糖的添加濃度較低時，藻體的絮凝率隨殼聚糖濃度的加大而升高，添加質(zhì)量濃度為30 mg/L時，絮凝效果最佳，可達到43.0%。但是，當添加質(zhì)量濃度超過30 mg/L時，其絮凝效率卻顯著降低，這可能因為過高濃度的殼聚糖無法完全溶解于藻液中，反而阻礙了藻體的絮凝，導(dǎo)致絮凝效率降低。因此，殼聚糖的添加量為30 mg/L時，雨生紅球藻的絮凝效率最高。

圖4 殼聚糖分子量對雨生紅球藻絮凝率的影響Fig.4 Effects of chitosan MW on flocculation efficiency of Haematococcus pluvialis

圖5 殼聚糖添加量對雨生紅球藻絮凝率的影響Fig.5 Effects of chitosan dosage on flocculation efficiency of Haematococcus pluvialis

2.3.2 正交優(yōu)化實驗結(jié)果

根據(jù)單因素考察的試驗結(jié)果，進一步開展了殼聚糖濃度、殼聚糖分子量以及藻液pH的正交實驗，按3因素4水平設(shè)計正交試驗表，研究結(jié)果如表1所示。

由表2可知：3個因素(添加量、分子量、藻液pH)對雨生紅球藻絮凝效果的影響比較顯著。除此之外，通過比較極差R來判斷3個因素對雨生紅球藻絮凝效果的影響，研究發(fā)現(xiàn)藻液pH的影響最大，殼聚糖分子量其次，添加濃度的影響最小。通過K值的大小判定各因素的最優(yōu)水平，因此，3個因素的最優(yōu)條件組合為A1B1C1，即：pH為4，分子量為5.0×103，添加質(zhì)量濃度為20 mg/L時，雨生紅球藻的絮凝效果最佳，絮凝率達到74.8%。

表1 正交實驗設(shè)計及結(jié)果

表2 極差分析表

2.4 復(fù)合絮凝劑對雨生紅球藻絮凝效果的影響

為了進一步研究無機絮凝劑(SPFC)和生物絮凝劑(殼聚糖)在雨生紅球藻絮凝過程中的協(xié)同作用，根據(jù)前期的單一絮凝劑添加條件優(yōu)化試驗結(jié)果，本研究嘗試通過將無機絮凝劑的添加量減少1/4，與少量殼聚糖一起加入雨生紅球藻培養(yǎng)液，考察復(fù)合絮凝劑對雨生紅球藻絮凝效果的影響，結(jié)果如表3所示。由表3可知：當SPFC和殼聚糖協(xié)同作用時，絮凝率達到最大值(97.0%)，遠遠高于二者單獨使用時的絮凝率。并且，通過二者協(xié)同作用，達到最大絮凝率的時間縮短了，僅為90 min，這對絮凝效率的提升和生產(chǎn)成本的降低也至關(guān)重要。分析原因，這可能是因為殼聚糖包覆在SPFC的表面，高分子鏈纏繞在SPFC周圍，比表面積增大，大大地增加了絮凝劑和雨生紅球藻的接觸機會，因此用量減少，同時絮凝效果改善。另外，二者協(xié)同作用，還可以大大地避免無機絮凝劑(SPFC)過度使用對雨生紅球藻后續(xù)產(chǎn)品應(yīng)用所帶來的負面影響。

表3 不同絮凝方法的比較結(jié)果

3 結(jié)論

本研究將幾種常用無機絮凝劑應(yīng)用到雨生紅球藻采收工藝，SPFC作為絮凝劑使用時的絮凝效果最好，達到88.0%，最佳的添加質(zhì)量濃度為1.5 g/L，最佳的絮凝時間為120 min。同時，殼聚糖作為一種常見的生物絮凝劑，可以較好地被應(yīng)用到雨生紅球藻采收工藝研究中，其最佳的使用條件是：pH為4.0，分子量為5.0×103，添加質(zhì)量濃度為20 mg/L，絮凝率可達到74.8%，最佳的絮凝時間為120 min。為了減少無機絮凝劑(SPFC)的過多加入對雨生紅球藻后續(xù)產(chǎn)品應(yīng)用的影響，本研究嘗試性的將SPFC的添加量減少1/4，并且和殼聚糖混合使用作為復(fù)合絮凝劑應(yīng)用于雨生紅球藻的采收工藝中，研究結(jié)果表明，SPFC和殼聚糖協(xié)同作用時，絮凝率達到最大值(97.0%)，遠遠高于二者單獨使用時的絮凝率。并且，通過二者協(xié)同作用，達到最大絮凝率的時間縮短了，僅為90 min，這對雨生紅球藻絮凝效率的提升和生產(chǎn)成本的降低至關(guān)重要。

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(責(zé)任編輯 荀志金)

Effects of Flocculants on recovery ofHaematococcuspluvialis

PENG Chao1,2,SU Huibo1,2,XIONG Qiang1,2,LI Fan1,2,LIN Hailong1,2

(1. Nutrition and Health Research Institute,COFCO,Beijing 102209,China;2. National Energy Biological Liquid Fuel R&D Center,Beijing 102209,China)

Aimed to find the optimum flocculants to accelerate the gathering ofHaematococcuspluvialis,several commonly used inorganic and biological flocculants were selected to study their effects on recovery ofHaematococcuspluvialis.The results indicated that polymeric ferric sulfate(SPFC) was the best inorganic flocculant.The optimum conditions were as follows:1.5 g/L,120 min,and the flocculation rate reach up to 90.0%. Chitosan,as an excellent bioflocculant,was also used in this study.The optimum conditions were as follows:pH 4.0,5.0×103,20 mg/L,and the flocculation rate reach up to 74.8%.Furthermore,when SPFC and chitosan were add to the culture broth ofHaematococcuspluvialistogether,the flocculation rate reaches the maximum value(97.0%),more than the best result controlled by single use of either flocculant.By using this mixed flocculants,the time for maximum recovery was shortened obviously(90 min),flocculation effect is significantly improved.SPFC and chitosan could be used in the large-scale collection ofHaematococcuspluvialis

Haematococcuspluvialis;astaxanthin;flocculants;chitosan

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.001

2016-09-13

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA023107、2014AA021906)

彭 超(1985—)，男，湖南漢壽人，博士，研究方向：生物能源與生物化工，E-mail:pengchao@cofco.com

Q949.2

A

1672-3678(2017)02-0001-06