王海濤，徐革鋒，湯施展

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070）

銅對細(xì)鱗鮭幼魚鰓和肝組織的急性毒性

王海濤，徐革鋒，湯施展

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江哈爾濱150070）

在水溫（16±0.5）℃下，采用靜水實(shí)驗(yàn)法研究不同濃度的銅離子對體質(zhì)量（35.8±9.6）g的細(xì)鱗鮭Brachymystaxlenok幼魚鰓和肝臟的急性毒性，銅離子濃度為24h半致死濃度（LC50）的1/4倍、1/2倍，及1倍。結(jié)果表明：銅脅迫初期細(xì)鱗鮭幼魚的鰓充血而顏色而變暗，后期鰓血管和細(xì)胞病變，顏色變淺。鰓絲先彎曲，然后潰爛，最后脫落；肝臟出血、腫大，切片顯示肝臟細(xì)胞空泡化，后期可以看到壞死的細(xì)胞核。銅離子對細(xì)鱗鮭幼魚的鰓和肝臟組織有明顯的破壞作用，是銅急性中毒致死的原因之一。

細(xì)鱗鮭；銅；急性毒性

銅是河流常見的重金屬污染物之一，銅通過呼吸和攝食等活動(dòng)進(jìn)入魚類等水生生物體內(nèi)，破壞魚體的部分組織和器官[1-3]，導(dǎo)致魚類死亡，甚至威脅到人類的安全。銅對水生動(dòng)物的毒性效應(yīng)受溫度等理化因素的影響，銅對水生生物的毒性作用研究也較多，但大部分集中在常溫下（20℃左右），對低溫（16℃左右）下的毒理效應(yīng)研究較少。低溫下水生生物的消化、呼吸、代謝等活動(dòng)較慢，會(huì)直接影響到銅對水生生物的毒性。我國北方地區(qū)的河流在冬季水溫較低，部分河流還要經(jīng)歷冰封期，而這個(gè)階段也是漁業(yè)污染事故的多發(fā)期。所以，考察低溫下毒物對魚類等水生生物的毒理效應(yīng)非常重要。細(xì)鱗鮭Brachymystax lenok是我國秦嶺周邊及黑龍江、烏蘇里江等河流中生活的著名的冷水性魚類。本文考察通過研究16℃下銅離子（硫酸銅）對細(xì)鱗鮭幼魚鰓、肝等組織器官的損害，為研究水環(huán)境中污染物的低溫毒理學(xué)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)魚體長（16.2±3.2）cm，體質(zhì)量（35.8±9.6）g，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所繁殖、馴養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前魚類攝食、呼吸、游動(dòng)正常。實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，銅離子為分析純硫酸銅溶于去離子水，按照實(shí)驗(yàn)所需濃度稀釋，加入水族箱。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖在農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)檢中心（哈爾濱）的精確控溫養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水族箱為長方形（50cm×50cm×50cm），水深40cm。水溫控制在（16±0.5）℃，保持連續(xù)充空氣，實(shí)測溶解氧濃度為（8.0±0.5）mg·L-1，pH（7.3±0.2）。預(yù)實(shí)驗(yàn)得到的24h半致死濃度LC50為0.88mg·L-1，銅對細(xì)鱗鮭幼魚鰓和肝組織損傷的實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)濃度梯度，分別為高濃度組（H組，銅離子濃度為0.88mg·L-1）、中濃度組（M組，銅離子濃度為0.44 mg·L-1）和低濃度組（L組，銅離子濃度為0.22mg·L-1），同時(shí)設(shè)置空白組（N組，銅離子濃度為0.00 mg·L-1）。

每次取10～15條魚的鰓和肝臟組織樣品，固定在Bouin’s液中，7d內(nèi)橫向和縱向切片，切片厚度5μm，經(jīng)H.E.染色，中性樹脂封片，觀察和拍照后，用Motic3.2圖形軟件處理獲得的圖像信息。組織切片照相系統(tǒng)為Carl Zeiss Microlmaging GmbH 3708數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫下細(xì)鱗鮭幼魚的應(yīng)激反應(yīng)和表觀變化

實(shí)驗(yàn)初期，實(shí)驗(yàn)魚表現(xiàn)出驚悸、呼吸急促的狀況，并且口吻張開度逐漸增大，兩側(cè)鰓蓋鼓動(dòng)幅度和頻率加快（圖1）；中期部分幼魚身體逐漸失去平衡，游動(dòng)時(shí)撞擊水族箱壁，靜止時(shí)側(cè)面朝上，一段時(shí)間之后，腹部向上漂浮在水中，偶爾游動(dòng)一下；末期沉入水底，全身輕微顫抖，偶爾呼吸，直到死亡。銅脅迫下，實(shí)驗(yàn)魚鰓部發(fā)生明顯的病變。實(shí)驗(yàn)初期鰓的顏色變暗，后期中毒接近死亡，鰓逐漸失去呼吸及氣體交換等功能，顏色變淺（圖1）。水體中銅的濃度越大，魚類受到的毒性越大，鰓的顏色越淺。

圖1 銅脅迫下幼魚的應(yīng)激反應(yīng)Fig.1The response of the juveniles exposed to copper stress

2.2 銅脅迫下細(xì)鱗鮭幼魚鰓的變化

實(shí)驗(yàn)初期，實(shí)驗(yàn)魚的鰓絲顏色變暗，鰓絲上附著藍(lán)色絲狀物質(zhì)；后期鰓絲顏色變白、鰓組織潰爛。低濃度組（L組）鰓絲整體變彎曲，到中濃度組（M），鰓絲開始部分脫落，高濃度組（H組）鰓絲潰爛，組織開始壞死（圖2）。

圖2 銅脅迫下幼魚鰓絲的整體變化Fig.2The overall histological changes in gill filaments of the juveniles exposed to copper stress

組織學(xué)觀察表明（圖3）：低濃度組（L組）實(shí)驗(yàn)魚鰓絲根部部分組織開始出現(xiàn)病變，組織表面不平滑，出現(xiàn)壞死細(xì)胞；中濃度組（M組）魚鰓絲根部斷裂、脫落；高濃度（H組）組實(shí)驗(yàn)魚鰓絲根部組織完全破壞。

圖3 銅脅迫下幼魚鰓絲根部的變化Fig.3Changes in bases of gill filaments of the juveniles exposed to copper stress

細(xì)鱗鮭幼魚在銅脅迫下鰓絲末端腫脹，呈囊狀，上皮細(xì)胞增生，中濃度組實(shí)驗(yàn)魚鰓絲上皮細(xì)胞開始壞死，高濃度組鰓絲上皮細(xì)胞開始脫落，鰓絲末端潰爛（圖4）。

2.3 銅脅迫下細(xì)鱗鮭幼魚肝的變化

低濃度組細(xì)鱗鮭幼魚肝毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，肝臟腫大；中濃度組幼魚的肝細(xì)胞顆粒變性，部分肝細(xì)胞空泡變性，有的肝細(xì)胞胞漿凝固，形成較多圓形或橢圓形小體；高濃度組實(shí)驗(yàn)魚肝細(xì)胞產(chǎn)生空泡病變，嚴(yán)重者肝組織局部壞死、溶解，形成溶解性壞死病灶,甚至只能看到壞死的細(xì)胞核（圖5）。

圖4 幼魚鰓絲末端組織切片F(xiàn)ig.4Changes in the gill filament of the juveniles exposed to copper stress

圖5 細(xì)鱗鮭幼魚肝臟組織切片F(xiàn)ig.5Sections in liver of juveniles exposed to copper stress

3 討論

3.1 銅對細(xì)鱗鮭幼魚鰓的影響

鰓是硬骨魚類的呼吸器官和氣體交換的主要場所，對氧在魚體內(nèi)的平衡和交換中起重要作用。大致認(rèn)為銅對魚類鰓的毒性，一是重金屬阻塞鰓絲與水體的接觸，從而抑制水生動(dòng)物的呼吸；二是重金屬誘發(fā)水生動(dòng)物鰓部的的淋巴病變而破壞鰓的呼吸機(jī)能[16]。鰓的病變會(huì)影響魚類呼吸和循環(huán)等生理功能，甚至威脅到魚類的生存[4-6]。梁濤等[7]認(rèn)為生活在銅污染水體中的魚，鰓部富集的銅比其他組織高一個(gè)數(shù)量級。王利等[8]報(bào)導(dǎo)銅能直接損傷鰓，破壞鰓小片，使鰓小片上皮細(xì)胞病變，阻礙氣體交換，導(dǎo)致魚窒息死亡[8-10]。銅暴露下實(shí)驗(yàn)魚的鰓瓣融合，鰓組織破壞，影響魚類的呼吸活動(dòng)[11-13]，說明鰓是魚類銅中毒的重要靶器官之一。

3.2 銅對細(xì)鱗鮭幼魚肝的影響

肝臟是生物體的重要器官，在循環(huán)系統(tǒng)中承擔(dān)分解毒物的作用。有報(bào)導(dǎo)稱毒物能破壞動(dòng)物肝臟細(xì)胞，造成肝臟溶解性壞死，導(dǎo)致魚類死亡[14,15]。切片結(jié)果顯示，銅脅迫下細(xì)實(shí)驗(yàn)魚肝臟腫大，高濃度組死亡幼魚的肝臟有出血的現(xiàn)象，肝臟細(xì)胞大部分已經(jīng)死亡，可見到死亡的細(xì)胞核。肝臟的變化也是導(dǎo)致魚類銅急性中毒死亡的重要原因。

3.3 低溫下銅對細(xì)鱗鮭幼魚的毒理作用

低溫下銅對細(xì)鱗鮭幼魚鰓和肝有明顯的破壞作用，鰓絲末端呈囊狀腫大，鰓絲根部破壞至潰爛脫落，肝臟腫大、出血，干細(xì)胞空泡化、壞死，細(xì)胞核凋亡。王利等[8]的研究表明，水環(huán)境中的銅能損傷魚類的鰓、腸、肝、腎、腦，特別是對鰓的損害與鯉Cyprinus carpio的死亡有很大的關(guān)系。朱友芳等[15]的研究成果顯示，銅離子脅迫損害了中國花鱸Lateolabrax maculatus幼魚肝臟的抗氧化系統(tǒng)、肝臟組織和鰓部組織,并具有一定的遺傳毒性。這說明低溫下銅對細(xì)鱗鮭幼魚的毒理作用和常溫下銅對鯉、中華鱘Acipenser sinensis、花鱸的毒理作用大致相同[8,9,15]。換算成相同體質(zhì)量，低溫下細(xì)鱗鮭幼魚的24h的LC50是常溫下魚類的一倍左右，表現(xiàn)出對銅的較強(qiáng)的耐受力，所以研究中可以結(jié)合低溫下魚類代謝速度較慢或者呼吸速度較慢等因素探討低溫下魚類對銅耐受力較強(qiáng)的原因。

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Acute Toxicity of Copper to Gill and Liver of Juvenile Brachymystax lenok

WANG Hai-tao,XU Ge-feng,TANG Shi-zhan
（Heilongjiang Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China）

The acute toxicity of copper ion to gill and liver of juvenile Brachymystax lenok was studied under low temperature（16± 0.5）℃.The concentrations of copper ion are 0.88 mg.L-1,0.44 mg·L-1,0.22 mg·L-1,0.00 mg·L-1.In the early stage of experiment,the overall color of gill became dark because of congestion,and change shallow in color in the later stage.Gill filements were changed from bending to fester,last fall.The liver was shown to change to bleeding,and swelling,and under the histological sections the hepotacytes were changed to bubble with the necrosis of the dead nuclei.The destruction of gill and liver by copper is one of the causes of acute poisoning death of the juvenile.

Brachymystax lenok;copper acute;toxicity

X522

A

1005-3832（2017）02-0022-04

2016-10-26

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（HSY201413）.

王海濤(1982-)，碩士，助理研究員,從事生態(tài)學(xué)和環(huán)境毒理學(xué)研究.E-mail:wanghaitao@hrfri.ac.cn