張健，龔元，于翔，李軍，蔣湘輝，李赫，張濤

（1.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧遼陽(yáng)111000；

2.荊州市民康生物科技有限公司，湖北荊州434300）

溫度和密度對(duì)日本醫(yī)蛭繁殖的影響

張健1，龔元2，于翔1，李軍1，蔣湘輝1，李赫1，張濤1

（1.遼寧省淡水水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧遼陽(yáng)111000；

2.荊州市民康生物科技有限公司，湖北荊州434300）

在實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)箱中，研究溫度（24±1）℃和（20±1℃）與密度（200尾/箱和100尾/箱）對(duì)平均體質(zhì)量1g左右的日本醫(yī)蛭Hirudo nipponia親蛭交配率、減重率、產(chǎn)繭數(shù)量和體質(zhì)量的影響，比較卵繭質(zhì)量（＜0.05g、0.05～0.1g和＞0.1g）對(duì)孵出仔蛭數(shù)量的影響。結(jié)果表明：溫度（24±1）℃、密度100尾/箱時(shí)親蛭交配率（86± 0.06）%和平均產(chǎn)繭量（0.87±0.14）枚/尾最高；親蛭產(chǎn)繭后平均體質(zhì)量下降（32.1±0.059）%；繁殖期間共收集卵繭870枚，孵化率87.47%；平均卵繭質(zhì)量為（0.11±0.009）g（變化范圍0.03g～0.25g）；密度和溫度對(duì)產(chǎn)繭量的影響極顯著（P＜0.01），對(duì)卵繭平均質(zhì)量和長(zhǎng)短徑的影響不顯著（P＞0.05）；（24±1）℃組親蛭的產(chǎn)繭時(shí)間比（20± 1）℃組縮短10～15d，單日卵繭最高收集量為43枚，（20±1）℃時(shí)單日最高收集量24枚；卵繭共孵出仔蛭5 648尾，隨著卵繭質(zhì)量增加產(chǎn)出的仔蛭數(shù)量和質(zhì)量也增加。

日本醫(yī)蛭；溫度；密度；繁育

日本醫(yī)蛭（Hirudo nipponia Whitman，1886）（水蛭）隸屬于環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)蛭綱無(wú)吻蛭目醫(yī)蛭科醫(yī)蛭屬，主產(chǎn)于日本、蒙古等地，在我國(guó)北起東北各省和內(nèi)蒙古，西至四川和甘肅，南達(dá)臺(tái)灣和廣東均有發(fā)現(xiàn)[1]。水蛭體內(nèi)分泌的抗凝血水蛭素具有防治動(dòng)脈粥狀硬化、高血壓、高血脂、抗血栓和腦中風(fēng)等疾病[2-8]，破血通徑、消積散淤、消腫解毒的功能[9]，廣泛應(yīng)用于臨床防治人類(lèi)心腦血管疾病，在美容護(hù)膚品和保健品等領(lǐng)域也有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

近年來(lái)，水蛭的生存環(huán)境不斷惡化及人為的過(guò)度捕抓，野生資源破壞嚴(yán)重，野生種群數(shù)量銳減[11,12]。為了保護(hù)野生資源和臨床、科研的需要，水蛭人工繁殖與養(yǎng)殖勢(shì)在必行。目前，俄羅斯、英國(guó)、法國(guó)和土耳其等國(guó)家已經(jīng)擁有相當(dāng)規(guī)模的水蛭養(yǎng)殖業(yè)[13]，而我國(guó)水蛭繁養(yǎng)殖技術(shù)研究較少，規(guī)?；B(yǎng)殖企業(yè)更是屈指可數(shù)。因此在人工養(yǎng)殖條件下，本文通過(guò)研究溫度和密度對(duì)水蛭繁殖的影響，優(yōu)化人工繁殖技術(shù)，為規(guī)?；别B(yǎng)技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)水蛭來(lái)源于遼寧省遼中縣，平均體質(zhì)量1g左右，規(guī)格均一，無(wú)傷病，活力旺盛，無(wú)生殖環(huán)帶。

養(yǎng)殖用土壤采自遼寧省遼陽(yáng)市郊稻田，經(jīng)新潔爾滅消毒、沖洗、曬干過(guò)40目篩后，布入網(wǎng)箱（350mm×145mm×115mm）中，然后再放入同規(guī)格的塑料箱（380mm×175mm×145 mm）中備用。

1.2 方法

1.2.1 親蛭飼養(yǎng)管理

在塑料飼養(yǎng)箱內(nèi)放置網(wǎng)箱，網(wǎng)箱里放入厚4cm的土層，鋪平，用曝氣3d的自來(lái)水浸透后放入水蛭。養(yǎng)殖期間，根據(jù)土壤的潮濕度，每3d噴灑一次曝氣水。為防止噴灑時(shí)對(duì)親蛭產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，水溫保持與土溫基本一致。室內(nèi)保持安靜，日常操作輕慢，最大程度降低對(duì)親蛭的影響。

1.2.2 溫度和密度對(duì)水蛭交配、產(chǎn)繭和孵化的影響實(shí)驗(yàn)

試驗(yàn)分別在（24±1）℃和（20±1）℃恒溫室進(jìn)行。每個(gè)溫度設(shè)置2個(gè)密度，200尾/箱和100尾/箱，每個(gè)處理2個(gè)重復(fù)。每箱水蛭隨機(jī)抽取30%的個(gè)體稱(chēng)量體質(zhì)量（精確到0.01g），稱(chēng)量前用微濕的紗布去除水蛭體表附著的贓物和水分。每5d翻土檢查一次，挑出有生殖環(huán)帶的水蛭，記錄產(chǎn)繭情況。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，計(jì)算親蛭交配率、減重率、平均產(chǎn)繭量及卵繭的大小和質(zhì)量。

1.2.3 卵繭的孵化方式

在（26±1）℃恒溫室內(nèi)，按試驗(yàn)要求，把卵繭放入塑料箱（380mm×175mm×145mm）和塑料盒（170mm×110mm×70mm）中，塑料箱內(nèi)放入網(wǎng)箱（350mm×145mm×115mm），防止水蛭逃跑。塑料箱和塑料盒內(nèi)加入1cm的曝氣水，網(wǎng)箱和塑料盒內(nèi)放置培養(yǎng)皿，卵繭放在培養(yǎng)皿上，蓋上醫(yī)用紗布，紗布兩端浸在水中，使卵繭保持一定的濕度。每天清洗和更換紗布和水。

1.2.4 卵繭質(zhì)量對(duì)孵出仔蛭數(shù)量的影響試驗(yàn)

從所產(chǎn)的卵繭中，選取0.05g以下、0.05～0.1g和0.1g以上三種規(guī)格卵繭各10枚，分別放入塑料盒（170mm×110mm×70mm）中，蓋上紗布，統(tǒng)計(jì)每枚卵繭孵化仔蛭的數(shù)量。每種規(guī)格卵繭2個(gè)重復(fù)。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析，試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），當(dāng)P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度和密度下水蛭的交配率和減重率

在北方野外實(shí)地觀察發(fā)現(xiàn)，4月下旬越冬后水蛭生殖孔凸起，5月中下旬大量水蛭有生殖環(huán)帶，6月初開(kāi)始產(chǎn)繭，未交配水蛭生殖孔逐漸消退。由此，本試驗(yàn)交配統(tǒng)計(jì)時(shí)間從5月4日試驗(yàn)分組至6月5日產(chǎn)出第一枚卵繭截止，共33d。由表1可知，溫度和密度對(duì)水蛭交配影響較大。同一溫度下，低密度組的交配率高于高密度組；密度相同時(shí)，（24±1）℃組高于（20±1）℃組。四組中最高交配率達(dá)86%，最低為66%，各組間差異性顯著（P＜0.05）。

由表2可知，溫度和密度對(duì)水蛭減重率無(wú)顯著性差異（P＞0.05），各組減重率變化在30%～35%之間，平均減重率（32.1±0.059）%。

表1 交配量及交配率Tab.1The mating number and mating rate of leech Hirudo nipponia in various groups

表2 各試驗(yàn)組水蛭產(chǎn)繭前后體質(zhì)量變化Tab.2The changes in body weight of the leeches before and after they released cocoons in various groups

2.2 不同溫度和密度下水蛭的產(chǎn)繭量、卵繭質(zhì)量和產(chǎn)繭時(shí)間

2.2.1 產(chǎn)繭量和卵繭質(zhì)量

將有生殖環(huán)帶的水蛭挑出，分箱養(yǎng)殖，約10d逐漸開(kāi)始產(chǎn)繭。試驗(yàn)期間共獲得870枚卵繭，其中死繭和空繭109枚，用于孵化繭計(jì)761枚，孵化成功率87.47%。最大卵繭0.25g，最小0.03g，平均（0.11±0.009）g。

死繭鑒定：孵化期49d，孵化結(jié)束時(shí)，將剩余卵繭挑出，朝向光源觀察。如果卵繭透光則孵化成功，如果渾濁則記為死繭。剪開(kāi)死繭，可見(jiàn)里面渾濁膠狀液體，為未受精的卵繭。

由表3可知，在相同溫度下，低密度組的平均產(chǎn)繭量高于高密度組，第4組最高，為0.87枚/尾，第3組最低，僅0.52枚/尾。溫度和密度對(duì)平均產(chǎn)繭量差異極顯著（P＜0.01），而對(duì)卵繭平均質(zhì)量、長(zhǎng)徑和短徑差異不顯著（P＞0.05）。

由圖1，質(zhì)量0.05g以上的卵繭較多，其中質(zhì)量0.05～0.1g的產(chǎn)卵繭127枚，占總產(chǎn)繭量的43.8%；0.1g以上的繭152枚，占總產(chǎn)繭量的52.4%；而0.05g以下的繭11枚，僅占總產(chǎn)繭量的3.8%。

2.2.2 溫度對(duì)產(chǎn)繭時(shí)間集中度的影響

由圖2可知，溫度顯著影響產(chǎn)繭時(shí)間。第3和第4組集中產(chǎn)繭和結(jié)束產(chǎn)繭的時(shí)間均比第1和第2組提前約10～15d。第1和第2組產(chǎn)繭曲線較平緩，即產(chǎn)繭量少，產(chǎn)繭期較長(zhǎng)，約有20d集中產(chǎn)繭，6月30日產(chǎn)繭量最高，為24枚；而第3和第4組集中產(chǎn)繭時(shí)間約有15d，6月15日產(chǎn)繭量最高，為43枚。

2.3 卵繭的孵化效果

2.3.1 卵繭的孵化率

在（26±1）℃恒溫室內(nèi)，卵繭經(jīng)49d孵化（2016年6月5日至2016年7月23日），共孵出仔蛭5 648尾。

2.3.2 不同質(zhì)量卵繭孵出的仔蛭數(shù)量及其體質(zhì)量

從圖3可知，質(zhì)量0.05g以下、0.05～0.1g和0.1g以上三種規(guī)格卵繭分別孵出（5.9±1.37）尾、（7.2± 0.789）尾和（8.5±0.972）尾仔蛭。隨著卵繭質(zhì)量的提高，孵出仔蛭的數(shù)量也隨之增加。從不同規(guī)格卵繭孵出的仔蛭中各隨機(jī)抽取30尾，用干凈紗布擦干體表水后稱(chēng)重，發(fā)現(xiàn)隨著繭質(zhì)量增加，仔蛭體質(zhì)量也相應(yīng)提高（圖4），三種規(guī)格卵繭孵出的仔蛭平均體質(zhì)量分別為（0.0022±0.0006）g、（0.0045± 0.0015）g和（0.0077±0.0025）g。從質(zhì)量輕的卵繭孵出的仔蛭體表顏色淺，略發(fā)土黃色，朝向陽(yáng)光處輕微透光；而質(zhì)量較重的卵繭孵出的仔蛭體表顏色深，發(fā)黑，無(wú)透光現(xiàn)象。

表3 不同試驗(yàn)組水蛭的產(chǎn)繭量及卵繭的性狀Tab.3The amount and characteristics of cocoons released by leeches in various groups

圖1 不同體質(zhì)量蛭的產(chǎn)卵繭量Fig.1The number of cocoons released by leeches with various body weight

圖2 各組蛭不同時(shí)間的產(chǎn)繭量Fig.2The cocoon production of leeches in different groups at various time

圖3 不同質(zhì)量的卵繭孵出的仔蛭數(shù)量Fig.3The number of newly hatched larvae from cocoons with various weight

圖4 不同質(zhì)量的卵繭孵出的仔蛭體質(zhì)量Fig.4The body weight of newly hatched larvae from cocoons with various weight

3 討論

3.1 溫度和密度對(duì)水蛭交配率和產(chǎn)繭前后體質(zhì)量的影響

遼寧大部分地區(qū)4月下旬氣溫逐漸升高，白天最高可達(dá)22℃左右。水蛭從4月中旬陸續(xù)結(jié)束越冬，白天氣溫較高時(shí)開(kāi)始覓食。5月中下旬發(fā)現(xiàn)大量有生殖環(huán)帶的水蛭。

本試驗(yàn)參考自然溫度，設(shè)置兩個(gè)溫度梯度，旨在摸索出北方水蛭最佳交配的溫度條件。結(jié)果表明，相同密度下，（24±1）℃時(shí)的交配率明顯高于（20±1）℃，最高交配率可達(dá)（86±0.06）%，說(shuō)明適宜溫度范圍內(nèi)，溫度越高，水蛭活力增強(qiáng)，交配幾率增加，這與史紅專(zhuān)等[14]所得結(jié)果相似。在相同溫度下，隨著養(yǎng)殖密度的提高，醫(yī)蛭活動(dòng)空間變小，親蛭之間形成地域競(jìng)爭(zhēng)，使得交配率明顯下降。這與石萍等[15]關(guān)于養(yǎng)殖密度對(duì)交配產(chǎn)繭影響的結(jié)論一致。試驗(yàn)中，醫(yī)蛭產(chǎn)卵繭后減重率變化在30%～35%之間，溫度和密度對(duì)水蛭減重率的影響差異不顯著（P＞0.05）。

3.2 溫度和密度對(duì)水蛭產(chǎn)繭量的影響

本試驗(yàn)中，不同溫度和密度下每尾水蛭的產(chǎn)繭量差異極顯著（P＜0.01）；對(duì)卵繭平均質(zhì)量、長(zhǎng)短徑的影響差異不顯著（P＞0.05）?？梢?jiàn)，溫度和密度是影響水蛭產(chǎn)繭量的重要因素[16]。

在繁殖過(guò)程中，有個(gè)別水蛭出現(xiàn)未產(chǎn)繭但生殖環(huán)帶褪去現(xiàn)象，形成了假受精。這可能是在受精過(guò)程中，受到外界應(yīng)激性刺激或其它水蛭的驚擾，高密度組中此現(xiàn)象較嚴(yán)重。在日常管理中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)有人為刺激時(shí)，產(chǎn)繭水蛭會(huì)逃逸，所產(chǎn)卵繭要么未成形，要么未形成土黃色蜂窩狀海綿體保護(hù)膜，這種卵繭孵不出仔蛭。所以，在繁殖過(guò)程中要盡量減少人為刺激。這與李軍[17]關(guān)于寬體金線蛭Whitmania pigra繁殖的研究結(jié)果相同，與張彬等[18]過(guò)多的應(yīng)激性刺激對(duì)菲牛蛭Hirudinaria manillensis繁殖性能有負(fù)面影響的結(jié)論相近。

3.3 水蛭產(chǎn)繭前后形態(tài)變化及卵繭形態(tài)特征

性成熟的水蛭生殖孔凸起，纏繞交配，受精后一周左右形成明顯淺于體表的土黃色生殖環(huán)帶。待產(chǎn)繭結(jié)束后，生殖環(huán)帶消失。卵繭呈橢圓形，最外部是一層海綿狀保護(hù)層，里面是卵繭膜，這與寬體金線蛭和菲牛蛭[19,20]相關(guān)文獻(xiàn)資料所述一致。

3.4 卵繭質(zhì)量對(duì)孵出仔蛭數(shù)量和質(zhì)量的影響

從三種規(guī)格卵繭中分別孵出仔蛭（5.9±1.37）尾、（7.2±0.79）尾和（8.5±0.97）尾。隨著卵繭質(zhì)量的提高，孵出的仔蛭數(shù)量也隨之增加，單卵繭最多孵出12尾仔蛭，最低4尾。最低孵化量與石萍等[15]的結(jié)果吻合，但最大孵化量有一定差距，主要是因?yàn)槟戏胶捅狈降乃紊姝h(huán)境和生態(tài)習(xí)性不同，北方水蛭的越冬時(shí)間長(zhǎng)，攝食時(shí)間短，個(gè)體略小，性成熟較慢。

卵繭質(zhì)量對(duì)孵出仔蛭體質(zhì)量影響較大。三種規(guī)格卵繭孵出仔蛭的平均體質(zhì)量為（0.0022±0.0006）g、（0.0045±0.0015）g和（0.0077±0.0025）g，隨著卵繭質(zhì)量的增加，仔蛭體質(zhì)量也增加。

本試驗(yàn)通過(guò)研究養(yǎng)殖環(huán)境對(duì)水蛭交配、產(chǎn)繭和孵化的影響，初步得出了不同階段的養(yǎng)殖條件和方法，為今后的人工養(yǎng)殖提供了參考。

［1］楊潼.中國(guó)動(dòng)物志·環(huán)節(jié)動(dòng)物門(mén)·蛭綱［M］.北京:科學(xué)出版社,1996:109-115.

［2］李明,武繼彪,劉聰聰.水蛭的臨床應(yīng)用綜述［J］.中醫(yī)研究,2006,19（8）:62-64.

［3］郭光業(yè),鄭彩華,趙劍鋒,等.復(fù)方水蛭膠囊防止動(dòng)脈粥樣硬化單因素效應(yīng)分析［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2007,18（3）:531-532.

［4］李艷玲,黃榮清,崔玉芳,等.水蛭的研究概況及展望［J］.科學(xué)技術(shù)與工程,2004,4（3）:239-243.

［5］王曉明,吳巖,李亞珍,等.水蛭注射液對(duì)大鼠血小板聚集和血栓形成的影響［J］.中成藥,1998,20（4）:27-28

［6］吳志軍,于立華.菲牛蛭及其制品的抗血栓、溶血栓作用［J］.中成藥,2007,29（4）:591-593.

［7］Li T,Wang G C,Wang C H,et al.Three new pteridines fromtheleech Whitmaniapigra［J］.Chemical Society,2013, 42（9）:983-985.

［8］Zhang B,Lin Qiang,Lin J D,et al.Effects of broodstock density and diet on reproduction and juvenile culture of the Leech,Hirudinaria manillensis Lesson,1842［J］.Aquaculture,2008,276（1）:198-204.

［9］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:77-78.

［10］王耀萍.科康天然水蛭素走向歐美［N］.中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào),2005-12-16,（11）:1.

［11］Elliott J M and Tullett P A.The status of the medicinal leech，Hirudo medicinalis in Europe and especially in the British isles［J］.Biological Conservation,1984,29（1）: 15-26.

［12］Wells S and W Coombes.The status of and trade in the medicinal leech［J］.Traffic Bull,1987（8）:64-69.

［13］張彬,儲(chǔ)霞玲,林強(qiáng),等.相對(duì)密度和季節(jié)對(duì)菲牛蛭繁殖習(xí)性的影響［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào),2010,49（5）:87-92.

［14］史紅專(zhuān),劉飛,郭巧生.溫度和體重對(duì)螞蟥人工繁育影響的研究［J］.中國(guó)中藥雜志,2006,31（24）:2030-2032.

［15］石萍,魯增輝,賀元川,等.水蛭（日本醫(yī)蛭）繁殖性能的研究［J］.中藥材,2015,38（6）:1144-1147.

［16］Mann K H.The breeding,growth and age structure of a population ofthe leech Helobdella stagnalis（L.）［J］.The Journal ofAnimal Ecology,1957,26（1）:171-177.

［17］李軍,于翔,宋文華,等.寬體金線蛭室內(nèi)產(chǎn)繭、孵化及仔蛭饑餓研究［J］.中國(guó)現(xiàn)代中藥,2012,14（11）:31-36.

［18］張彬,龔元,于翔,等.體重、年齡和應(yīng)激刺激對(duì)菲牛蛭繁殖性能的影響［J］.四川動(dòng)物,2012,31（3）:397-401.

［19］張濤,于翔,龔元,等.寬體金線蛭室內(nèi)繁殖的初步研究［J］.水產(chǎn)學(xué)雜志,2014,27（2）:52-60.

［20］譚恩光,黃立英,關(guān)瑩,等.廣東菲牛蛭生長(zhǎng)和生殖的研究［J］.中草藥,2002,33（9）:837-840.

Effects of Temperature and Density on Breeding of Leech Hirudo nipponia Whitman

ZHANG Jian1,GONG Yuan2,YU Xiang1,LI Jun1,JIANG Xiang-hui1,LI He1,ZHANG Tao1
（1.Freshwater Fisheries Science Academy of Liaoning Province,Liaoyang 111000,China;
2.Jingzhou Minkang Biotechnology Co.Ltd.,Jingzhou 434300,China）

The effects of temperature（24±1）℃and（20±1）℃and density（200 individuals and 100 individuals per cage）on mating rate of broodstock,number of cocoon and body weight were studied in leech（Hirudo nipponia）and effects of cocoon weight（＜0.05 g,0.05～0.1 g and＞0.1 g）on number of newly hatched larvae were also investigated.The results showed that the maximum mating rate（86±0.06）%and number of cocoon（0.87/leech）were observed at（24±1）℃and stocking density of 100 leeches/cage, with weight loss of（32.1±0.059）%in the leeches that released cocoons.A total of 870 cocoons with mean weight of（0.11± 0.009）g each,varying from 0.03 g to 0.25 g,were collected during breeding,with hatching rate of 87.47%.There was very significant effect of temperature and density on cocoon number released by leeches（P＜0.01）,without significant effect of temperature and density on long and short diameters of the cocoon and cocoon weight（P＞0.05）.The interval time of cocoon released by leeches was reduced by 10～15 d when the temperature rose from（20±1）℃to（24±1）℃,and the maximal daily amount of collected cocoon was 43 at（24±1）℃and 24 at（20±1）℃,with 5 648 individuals of newly hatched larvae during the experiment.The quantity and quality of newly hatched larvae was found to be improved with increase in weight of cocoon.

Hirudo nipponia Whitman;temperature;density;breeding

S966.9

A

1005-3832（2017）02-0017-05

2016-12-05

遼寧省海洋與漁業(yè)廳項(xiàng)目（200903）.

張?。?980-），男，工程師，碩士，從事水生生物疾病學(xué)研究.E-mail:zhangjlnly@126.com

于翔（1968-），男，教授級(jí)高級(jí)工程師.E-mail:yulnly@126.com