許艷起，張浩浩，楊 強(qiáng)，李超昆，牛怡倩，張改平，馬潤(rùn)林*，關(guān)貴全

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.中國(guó)科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所/分子發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046； 5.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

2種羊巴貝斯蟲的核型及系統(tǒng)發(fā)育分析

許艷起1,2,3,4，張浩浩3,4，楊 強(qiáng)3,4，李超昆3，牛怡倩3，張改平1,2,5*，馬潤(rùn)林3*，關(guān)貴全4*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.中國(guó)科學(xué)院 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所/分子發(fā)育生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所/家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046； 5.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002)

為明確引起羊巴貝斯蟲病的病原蟲莫氏巴貝斯蟲臨潭株(BabesiamotasiLintan,BLT)及羊巴貝斯蟲未定種新疆株(Babesiasp.Xinjiang,BXJ)的核型和親緣關(guān)系，通過DNA大片段脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)和三代高通量測(cè)序?qū)?種蟲體進(jìn)行核型分析和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明：2 種巴貝斯蟲都有4 條染色體，但基因組的大小與核型分析不一致，莫氏巴貝斯蟲臨潭株基因組大小為11.1 Mb，4 條染色體大小分別為6.0 Mb、3.0 Mb、1.1 Mb和1.0 Mb；羊巴貝斯蟲未定種新疆株基因組大小為7.0 Mb，4 條染色體分別為2.4 Mb、2.0 Mb、1.7 Mb和0.9 Mb；羊巴貝斯蟲未定種新疆株與牛巴貝斯蟲的親緣性較近，而莫氏巴貝斯蟲臨潭株與雙芽巴貝斯蟲的親緣關(guān)系較近。

莫氏巴貝斯蟲； 羊巴貝斯蟲未定種； 染色體； 核型分析； 系統(tǒng)發(fā)育分析

巴貝斯蟲病是由病原巴貝斯蟲通過蜱傳播的血液原蟲病，病原寄生于牛、羊、馬、犬等動(dòng)物的紅細(xì)胞中，可引起多種脊椎動(dòng)物發(fā)病。該病廣泛分布于溫帶、熱帶及亞熱帶地區(qū)，其危害僅次于錐蟲病，在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的影響[1-4]，臨床表現(xiàn)出發(fā)熱、溶血性貧血、黃疸、消瘦、衰弱、血紅蛋白尿(駑巴貝斯蟲除外)等癥狀[5-10]。

自巴貝斯蟲病被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員從其致病機(jī)制、入侵機(jī)制、代謝途徑、流行病學(xué)、病原特點(diǎn)等多方面開展了深入的研究，但在基因水平上的研究較少。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為該病的研究打開了契機(jī)，不少研究者從基因水平上開展了大量工作，主要集中于對(duì)牛巴貝斯蟲(B.bovis)、犬巴貝斯蟲、田鼠巴貝斯蟲(B.microti)的研究。Jones等[11]利用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)及端粒探針雜交技術(shù)對(duì)牛巴貝斯蟲染色體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，牛巴貝斯蟲有4 條單倍體基因組；Depoix等[12]用PFGE技術(shù)對(duì)犬巴貝斯蟲B.canis(歐洲種)和B.rossi(南非種)染色體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),B.canis和B.rossi單倍體基因組各由5條染色體組成；Brayton等[13]利用鳥槍法對(duì)牛巴貝斯蟲T2Bo株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，通過拼接組裝得到牛巴貝斯蟲的4 條染色體；Cornillot等[14]發(fā)表了田鼠巴貝斯蟲基因組序列數(shù)據(jù)。但目前未曾見到在基因組水平上對(duì)羊巴貝斯蟲研究的相關(guān)報(bào)道。

羊巴貝斯蟲病在我國(guó)甘肅、青海和四川等西部地區(qū)均有發(fā)生，對(duì)我國(guó)養(yǎng)羊業(yè)的持續(xù)發(fā)展造成了嚴(yán)重的阻礙。羊巴貝斯蟲主要有莫氏巴貝斯蟲和羊巴貝斯蟲未定種2 種，莫氏巴貝斯蟲專一性感染羊，在自然條件下有病例發(fā)生，通過血涂片可以檢測(cè)到蟲體，而羊巴貝斯蟲未定種在自然條件下無病例發(fā)生，通過血涂片檢測(cè)不到蟲體，但使用分子檢測(cè)技術(shù)可以檢測(cè)到病原[15-17]。為了研究2 種蟲原的致病性差異，從根本上了解2 種蟲原入侵機(jī)制、代謝途徑及致病機(jī)制，蘭州獸醫(yī)研究所于2010年開始開展了2 種羊巴貝斯蟲的基因組研究工作，對(duì)2 種蟲原進(jìn)行了二代基因組測(cè)序及基因組細(xì)菌人工染色體文庫(kù)(BAC)的構(gòu)建，并初步搭建了10 條羊巴貝斯蟲未定種新疆株框架，但沒有構(gòu)建莫氏巴貝斯蟲物理圖譜[18]。為此，以羊巴貝斯蟲未定種新疆株單克隆系G5及莫氏巴貝斯蟲臨潭株單克隆系G7為研究對(duì)象，通過核型分析獲得二者的染色體條數(shù)和大小，然后進(jìn)行三代高通量測(cè)序，利用測(cè)序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，找到與其親緣關(guān)系較近的物種，為構(gòu)建這2 種巴貝斯蟲精確的基因組序列圖譜奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試蟲原

供試羊巴貝斯蟲未定種新疆株(BXJ)單克隆系G5及莫氏巴貝斯蟲臨潭株(BLT)單克隆系G7由蘭州獸醫(yī)研究所寄生蟲病研究室提供。

1.2 蟲體的純化

參考Guan等[19]報(bào)道的巴貝斯蟲體外培養(yǎng)系，在體外紅細(xì)胞培養(yǎng)羊巴貝斯蟲未定種新疆株單克隆系G5及莫氏巴貝斯蟲臨潭株單克隆系G7。用體外培養(yǎng)系獲得的培養(yǎng)物感染除蜱羊(蘭州獸醫(yī)研究所提供)，當(dāng)除蜱羊染蟲率達(dá)到10%以上，頸靜脈采集抗凝血。過濾、離心去除白細(xì)胞，經(jīng)裂解紅細(xì)胞及差速離心等方法純化獲得2株巴貝斯蟲紅細(xì)胞階段的裂殖子，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蟲體的包埋與消化

分別取純化的莫氏巴貝斯蟲臨潭株及羊巴貝斯蟲未定種新疆株紅細(xì)胞階段的裂殖子各500 mL，并用Tris-NaCl(pH值7.4)將巴貝斯蟲裂殖子稀釋到1.0×108個(gè)/mL左右。將裂殖子與1%的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠在45 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min,在45 ℃水浴鍋中等體積混合并孵育5 min，期間輕輕連續(xù)吹打。然后將混合液轉(zhuǎn)移至用75%乙醇清洗過的冰模上，冰上放置15 min。將凝固的包埋塊置于100倍體積的裂解液(0.5 mol/L EDTA,pH值9.0,1% 十二雜基肌酸雜氨,1 mg/mL蛋白酶K)中，然后在分子雜交爐中50 ℃消化24 h，更換1次裂解液，相同條件下再消化24 h。取出低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋塊分別用20倍體積的含0.1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)和不含苯甲基磺酰氟的TE Buffer在冰上分別浸洗3次，每次1 h；最后將經(jīng)過預(yù)處理的包埋塊置于0.05 mol/L EDTA(pH值8.0)中，4 ℃保存?zhèn)溆肹20-21]。

1.4 DNA完整性檢測(cè)

將經(jīng)過預(yù)處理4 ℃保存的2種巴貝斯蟲裂殖子低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋塊各取1塊，分成1/2塊、1/4塊、1/8塊，置于1%的瓊脂糖凝膠中，進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳分析，檢測(cè)巴貝斯蟲裂殖子基因組中DNA的降解程度。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳條件：瓊脂糖凝膠濃度1%；電泳緩沖液：1×TAE；溫度：12.5 ℃；泵速：1 L/min；電場(chǎng)夾角：120°；起始脈沖時(shí)間：0.1 s；終止脈沖時(shí)間:40 s；電場(chǎng)強(qiáng)度：6 V/cm；電泳時(shí)間：16 h。

1.5 核型分析

將2 種經(jīng)過處理的巴貝斯蟲基因組低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋塊各取1塊，置于0.8%的瓊脂糖凝膠膠孔中，盡量排盡膠孔中的氣泡，且使包埋塊均勻填于膠孔中，然后再用0.8%的瓊脂糖凝膠封閉膠孔。進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳，對(duì)2株巴貝斯蟲的染色體進(jìn)行分析。

脈沖場(chǎng)凝膠電泳條件：電泳緩沖液：1×TAE緩沖液；電泳溫度：14 ℃；泵速: 1 L/min；起始脈沖時(shí)間:500 s；終止脈沖時(shí)間：500 s；電場(chǎng)夾角：106°；電場(chǎng)強(qiáng)度：3 V/cm；電泳時(shí)間：48 h。

1.6 系統(tǒng)發(fā)育分析

將純化的裂殖子階段的蟲體送武漢未來組生物科技有限公司，利用Pacbio三代高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定全基因組序列。將得到的2 種巴貝斯蟲全基因組數(shù)據(jù)與已經(jīng)發(fā)表的雙芽巴貝斯蟲(B.bigemina)[22]、牛巴貝斯蟲(B.bovis)[23]、田鼠巴貝斯蟲(B.microti)[14]、牛環(huán)形泰勒蟲(T.annulata)[24]、馬泰勒蟲(T.equi)[25]、牛環(huán)形東方泰勒蟲(T.orientalis)[26]、小泰勒蟲(T.parva)[27]、微小隱孢子蟲(C.parvum)[28]、弓形蟲(T.gondii)[29]和惡性瘧原蟲(P.falciparum)[30]的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行基因家族聚類，得到物種之間保守的單拷貝基因家族。使用 782 個(gè)單拷貝基因家族的蛋白質(zhì)序列，利用 Mafft軟件比對(duì)[31]，將蛋白質(zhì)序列比對(duì)轉(zhuǎn)換成 CDS 序列比對(duì)，使用 Gblocks軟件進(jìn)行過濾，得到CDS 文件[32]。最后采用RAx ML方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[33]，采用 GTRGAMMA模型，Bootstrap 設(shè)置為 100，以惡性瘧原蟲為外群物種。

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋塊中DNA的完整性檢測(cè)

DNA降解片段和核酸多糖等雜質(zhì)會(huì)在核型分析中出現(xiàn)多余條帶，直接影響核型分析的準(zhǔn)確性。圖1為2 種巴貝斯蟲基因組包埋塊脈沖場(chǎng)凝膠電泳的DNA的完整性檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)結(jié)果均為單一明亮條帶，且無小片段DNA及雜質(zhì)干擾。說明基因組包埋塊中DNA的降解較少，且雜質(zhì)處理比較干凈，可以用于下一步的染色體核型分析。

A：莫氏巴貝斯蟲臨潭株；B：羊巴貝斯蟲未定種新疆株；M：New England Biolabs 脈沖場(chǎng)凝膠電泳分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：1/2基因組包埋塊；2：1/4基因組包埋塊；3：1/8基因組包埋塊

2.2 核型分析

核型分析是研究物種進(jìn)化、分類及染色體結(jié)構(gòu)的重要手段。從圖2可以看出，莫氏巴貝斯蟲臨潭株和羊巴貝斯蟲未定種新疆株均有4 條染色體，但染色體大小有明顯的不同。莫氏巴貝斯蟲臨潭株4 條染色體，其大小分別為6.0 Mb、3.0 Mb、1.1 Mb和1.0 Mb；羊巴貝斯蟲未定種新疆株的4 條染色體，其大小分別為2.4 Mb、2.0 Mb、1.7 Mb和0.9 Mb。測(cè)序結(jié)果顯示，莫氏巴貝斯蟲臨潭株的基因組大小約為11.1 Mb，羊巴貝斯蟲未定種新疆株的基因組大小約為7.0 Mb。

A：羊巴貝斯蟲未定種新疆株；B：莫氏巴貝斯蟲臨潭株

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

在物種進(jìn)化過程中，由于單拷貝基因始終保持只有1個(gè)拷貝，所以該類基因在不同物種間是非常保守的，可以用于系統(tǒng)發(fā)育分析。通過單拷貝基因比對(duì)，得到莫氏巴貝斯蟲臨潭株、 羊巴貝斯蟲未定種新疆株與雙芽巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、田鼠巴貝斯蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、馬泰勒蟲、牛環(huán)形東方泰勒蟲、小泰勒蟲、微小隱孢子蟲、弓形蟲、惡性瘧原蟲的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(圖3)。由圖3可以看出，羊巴貝斯蟲未定種新疆株與牛巴貝斯蟲的親緣性較近，而莫氏巴貝斯蟲臨潭株與雙芽巴貝斯蟲有較近的親緣關(guān)系。

每個(gè)分支長(zhǎng)度代表進(jìn)化速率，分枝上數(shù)值代表 Bootstrap 支持?jǐn)?shù)

3 結(jié)論與討論

迄今為止，全世界報(bào)道的巴貝斯蟲有100多種，在世界范圍內(nèi)廣泛分布。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)巴貝斯蟲病的病原特性、傳播媒介、流行病學(xué)、入侵機(jī)制等方面做了很多研究，但是這些研究大多是基于表型分析入手，尋找已知功能的編碼基因，僅僅了解巴貝斯蟲的極少數(shù)的基因。而從基因組水平上對(duì)巴貝斯蟲的全基因進(jìn)行核苷酸測(cè)序，在了解全基因的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上研究各個(gè)基因單獨(dú)或數(shù)個(gè)基因間相互作用的功能還很少。為了從基因組水平上對(duì)我國(guó)廣泛分布的2 種羊巴貝斯蟲進(jìn)行相關(guān)研究，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所于2010年啟動(dòng)羊巴貝斯蟲未定種新疆株及莫氏巴貝斯蟲臨潭株基因組二代測(cè)序工作，測(cè)序結(jié)果顯示，羊巴貝斯蟲未定種新疆株的基因組大小約為7.8 Mb，與現(xiàn)已報(bào)道的其他梨形蟲的基因組大小基本一致；而莫氏巴貝斯蟲臨潭株測(cè)定的基因組大小約為17.6 Mb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于現(xiàn)已報(bào)道的梨形蟲的基因組[18]。與本研究進(jìn)行的大片段脈沖場(chǎng)凝膠電泳核型分析估測(cè)的結(jié)果(羊巴貝斯蟲未定種新疆株基因組大小7.0 Mb 和莫氏巴貝斯蟲臨潭株基因組大小11.1 Mb)相差比較大，并且測(cè)序拼接數(shù)據(jù)也不理想。

隨著三代高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)及成熟，2015年又進(jìn)行了三代高通量測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，羊巴貝斯蟲未定種新疆株有7條Scaffold，測(cè)序深度達(dá)到187.85 X，總堿基為8.5 Mb；莫氏巴貝斯蟲臨潭株有12條Scaffold，總堿基達(dá)到14 Mb，深度達(dá)到154.78 X[18]。三代高通量測(cè)序拼接數(shù)據(jù)更接近于2 種蟲原的染色體條數(shù)，同時(shí)三代測(cè)序結(jié)果與脈沖場(chǎng)凝膠電泳核型分析得到的數(shù)據(jù)也更加相近。雖然通過這2 種方法獲得的2 種巴貝斯蟲基因組的數(shù)據(jù)大小依然存在一定的差異，這可能是由于2 種方法本身的差異造成。雖然二者基因組的大小還需要做進(jìn)一步的驗(yàn)證，但2種方法來源的數(shù)據(jù)均可以表明，這2種巴貝斯蟲的基因組大小確實(shí)不同，而且初步確認(rèn)這2 種巴貝斯蟲都具有 4 條染色體。通過對(duì)得到的2 種蟲原的單拷貝基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得到2株巴貝斯蟲與牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的親緣性較近，而目前關(guān)于牛巴貝斯蟲和雙芽巴貝斯蟲的研究較深入，這為后續(xù)對(duì)莫氏巴貝斯蟲及羊巴貝斯蟲未定種相關(guān)的研究奠定一定的基礎(chǔ)。

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Karyotyping and Phylogeny of Two OvineBabesiaSpecies in China

XU Yanqi1,2,3,4，ZHANG Haohao3,4，YANG Qiang3,4，LI Chaokun3，NIU Yiqian3，ZHANG Gaiping1,2,5*，MA Runlin3*,GUAN Guiquan4*

(1.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China; 3.State Key Laboratory for Molecular Developmental Biology,Institute of Genetics and Developmental Biology/Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China; 4.State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/Lanzhou Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Science,Lanzhou 730046, China; 5.College of Veterinary Medicine and Animal Science,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

In order to make sure karyotype and genetic relationship ofBabesiamotasiLintan(BLT) andBabesiasp.Xinjiang(BXJ),the karyotype analysis and phylogenetic analysis were performed by pulsed field gel electrophoresis(PFGE) and 3 generation high-throughput sequencing.The results showed that both of them had 4 chromosomes.But the size of the genome was not consistent with karyotype analysis.Genome size of BLT was 11.1 Mb,and each chromosome size was 6.0 Mb,3.0 Mb,1.1 Mb and 1.0 Mb.Genome size of BXJ was 7.0 Mb with 4 chromosomes of 2.4 Mb,2.0 Mb,1.7 Mb and 0.9 Mb.Besides,phylogeny of the 2 parasites was analyzed on the basis of genomic data sequenced using third generation sequencing technique.Results indicated that BXJ had close genetic relationship withB.boviswhile BLT was more related withB.bigemina.

Babesiamotasi;Babesiasp.; chromosome; karyotyping; phylogeney

2016-08-30

家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(2015-MDB-05)

許艷起(1988-),女，河南周口人，在讀碩士研究生，研究方向：分子病原學(xué)與免疫學(xué)。 E-mail:xuyanqi0123@163.com

*通訊作者：張改平(1960-)，男，河南內(nèi)黃人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物免疫學(xué)及重大疫病快速檢測(cè)技術(shù)研究。 E-mail:zhanggaiping2003@163.com 馬潤(rùn)林(1958-)，男，甘肅成縣人，研究員，博士，主要從事人類及動(dòng)物功能基因組學(xué)研究。 E-mail:rlm@genetics.ac.cn 關(guān)貴全(1974-)，男，甘肅武山人，研究員，博士，主要從事動(dòng)物寄生蟲及其分子生物學(xué)研究。 E-mail：guanguiquan@caas.cn

S852.69

A

1004-3268(2017)03-0138-05