覃金梅,黃力毅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院·廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧530021)

念珠菌感染光動(dòng)力療法的研究進(jìn)展

覃金梅,黃力毅

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院·廣西艾滋病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南寧530021)

隨著廣譜抗生素的廣泛應(yīng)用，器官移植、免疫抑制治療及HIV感染病例的增多，真菌感染的發(fā)病率不斷增高。念珠菌是真菌相關(guān)性感染最常見的病原體，目前臨床上治療念珠菌感染仍以傳統(tǒng)抗真菌藥為主，但是由于臨床上預(yù)防性及反復(fù)治療的用藥，導(dǎo)致耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重。光動(dòng)力療法是指光敏劑在特定波長(zhǎng)的光源照射下，發(fā)生激化引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧物種導(dǎo)致靶細(xì)胞發(fā)生不可逆損傷的新型治療方法。針對(duì)念珠菌常用的光敏劑主要有卟啉類、吩噻嗪類、酞菁類。目前體外試驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均證實(shí)，PDT可以殺滅白色念珠菌。

光動(dòng)力療法；念珠菌；光敏劑

真菌感染是較常見的臨床問題，真菌相關(guān)性感染的病原體以念珠菌屬最常見。念珠菌屬是機(jī)會(huì)性致病菌，常寄生在人體的口腔、皮膚、腸道黏膜及陰道等部位。當(dāng)宿主免疫力低下或寄居處微環(huán)境發(fā)生改變，則易導(dǎo)致淺表性或全身系統(tǒng)性感染。目前抗念珠菌感染在臨床上仍以唑類抗真菌藥為主，同時(shí)予以多烯類、丙烯胺類及棘球白素類等輔助。然而由于預(yù)防性及大量反復(fù)用藥，耐藥問題日益凸顯。光動(dòng)力療法(PDT)是指利用特定波長(zhǎng)的光源照射光敏劑，使其發(fā)生激化，引起一系列光學(xué)級(jí)聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧物種從而導(dǎo)致靶細(xì)胞不可逆損傷的一種治療手段。以往常用于治療腫瘤疾病，直到近年來(lái)隨著感染、真菌及細(xì)菌耐藥問題的日益嚴(yán)重，越來(lái)越多的學(xué)者開始重新評(píng)估PDT在抗感染治療中的價(jià)值。本文從作用機(jī)制、常用光敏劑、體外研究、動(dòng)物研究及臨床研究等方面對(duì)PDT在抗念珠菌感染領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PDT抗念珠菌的作用機(jī)制

PDT的機(jī)制是通過局部或全身給予光敏劑，光敏劑優(yōu)先聚集于分裂生長(zhǎng)較旺盛的細(xì)胞或組織，經(jīng)過一段時(shí)間孵育，光敏劑選擇性地富集于病變部位。光敏劑吸收一定能量的光以后，產(chǎn)生電子激發(fā)態(tài)，由基態(tài)經(jīng)激發(fā)單重態(tài)系間竄躍快速生成激發(fā)三重態(tài)，此時(shí)光敏劑可通過兩種類型的反應(yīng)產(chǎn)生損害作用。Ⅰ型反應(yīng)中，光敏劑直接與底物或溶劑發(fā)生氫或電子的轉(zhuǎn)移，形成自由基或自由基離子，這些自由基又與氧進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等。Ⅱ型反應(yīng)則是三重態(tài)光敏劑直接轉(zhuǎn)移能量給氧，生成單重態(tài)氧，這是一種高反應(yīng)活性的氧化劑，具有親電性，能高效氧化不飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)、核酸和線粒體膜等生物分子。在兩種反應(yīng)中，這些活性氧的產(chǎn)生量決定著靶體損傷程度。而在不同的光敏劑、光照、底物等反應(yīng)條件下，活性氧的產(chǎn)量也不同，因此尋求合適的反應(yīng)條件至關(guān)重要。

2 抗念珠菌的光敏劑

光敏劑是光動(dòng)力效力的重要決定因素之一，目前針對(duì)念珠菌常用的光敏劑主要有卟啉類、吩噻嗪類、酞菁類。

2.1 卟啉類衍生物 卟啉類衍生物多為在第一代光敏劑的血卟啉結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化而來(lái)，主要分為內(nèi)源性和外源性兩大類。內(nèi)源性卟啉典型代表為5-氨基酮戊酸(5-ALA)，5-ALA不具備光敏性，參與血紅素的合成。靶細(xì)胞特異性吸收5-ALA，通過酶促反應(yīng)生成的原卟啉Ⅸ發(fā)揮光敏效應(yīng)[1]。5-ALA已被美國(guó)FDA認(rèn)證應(yīng)用于臨床，其甲基酯化合物在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)已被批準(zhǔn)用于基底細(xì)胞癌和光化性角化病的臨床治療，5-ALA具有的抗真菌性逐漸引起研究者們的注意。外源性卟啉主要包括二氫卟吩、葉綠素和卟啉等。其中，卟啉化合物中的血卟啉單甲醚(HMME)是屬于我國(guó)首創(chuàng)的一種單體卟啉新型光敏劑，具有光敏化力強(qiáng)、毒性低、有效成分明確等優(yōu)點(diǎn)，有較好的應(yīng)用前景。而在癌癥中應(yīng)用較廣的具有特異性聚集特性的血卟啉衍生物-Photogem?對(duì)念珠菌也有很好的滅活作用。

2.2 吩噻嗪類 吩噻嗪類藥物是吩噻嗪的衍生物，是一種三環(huán)結(jié)構(gòu)化合物，因側(cè)鏈結(jié)構(gòu)不同而分為三類，目前臨床上多將其作為精神類藥物使用。作為抗念珠菌的光敏劑該類復(fù)合物最常用的是亞甲藍(lán)(MB)、新亞甲藍(lán)、甲苯胺藍(lán)和二甲基藍(lán)(DMMB)。李慶妮等[2]比較了4種吩噻嗪類光敏劑，發(fā)現(xiàn)DMMB的抗念珠菌作用最強(qiáng)，這可能與光敏劑的親脂性有關(guān)，不過其對(duì)正常組織的較強(qiáng)光毒性導(dǎo)致了應(yīng)用的局限性。

2.3 酞菁類 酞菁是一類具有大分子共軛體系，由4個(gè)異吲哚組成的稠環(huán)化合物，最大吸收光譜位于670～780 nm可見光區(qū)，主要富集于細(xì)胞線粒體。酞菁類染料具有分子結(jié)構(gòu)易修飾的特點(diǎn)，新興的高效酞菁類化合物通過引入中心金屬原子及取代基團(tuán)使最大吸收光譜紅移，引入磺酸基等強(qiáng)極性基團(tuán)或者結(jié)合納米載體提高自身溶解性。目前硅酞菁Pc4的相關(guān)實(shí)驗(yàn)報(bào)道較多，Pc4是疏水性光敏劑，Pc4利用聚乙二醇樹狀大分子作為藥物遞送載體，可以促進(jìn)Pc的水溶性和防止非特異性吸收，對(duì)念珠菌起到了更強(qiáng)的殺滅效力[3]。

3 PDT抗念珠菌的體外研究

目前體外試驗(yàn)證實(shí)，PDT的滅菌率與一定范圍內(nèi)的光敏劑濃度具有正相關(guān)性，當(dāng)光敏劑達(dá)到合適的濃度時(shí)基本可以完全殺滅白色念珠菌[4]。Mima等[5]利用假牙模型，以Photogem?作為光敏劑分析比較了白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、都柏林念珠菌及克柔念珠菌對(duì)PDT的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱帶念珠菌、克柔念珠菌對(duì)PDT的敏感性較為突出，都柏林念珠菌敏感性最低，但較基線仍降低了1.73個(gè)log。念珠菌各種菌型對(duì)PDT的敏感性可能會(huì)因光敏劑的不同而發(fā)生變化，但造成這種現(xiàn)象的具體機(jī)制目前尚未明確。PDT對(duì)念珠菌各菌型的敏感性與抗生素的敏感性不同與二者作用機(jī)制有關(guān)。大部分傳統(tǒng)滅菌藥物的主要抑制真菌細(xì)胞膜中麥角固醇的合成，而PDT中的受光激發(fā)產(chǎn)生的ROS不僅對(duì)真菌壁及細(xì)胞膜具有滲透性，一旦進(jìn)入細(xì)胞實(shí)質(zhì)內(nèi)還可以直接損傷細(xì)胞器，增加磷脂酰絲氨酸的外部化和DNA的斷裂導(dǎo)致細(xì)胞死亡[6]。有相關(guān)文獻(xiàn)[4,7]發(fā)現(xiàn)，PDT對(duì)念珠菌絲、孢子及生物膜等均有抑制作用。生物膜是由菌體細(xì)胞外基質(zhì)形成的立體結(jié)構(gòu)菌落，是菌體躲避藥物及機(jī)體防御系統(tǒng)的重要屏障，生物膜內(nèi)白色念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性是浮游菌的1 000多倍[8]。De Figueiredo Freitas等[9，10]證實(shí)了PDT具有抑制白色念珠菌生物膜的效果。不過研究者們普遍認(rèn)為，PDT對(duì)生物膜中的念珠菌的殺傷力比一般浮游菌差。Gonzales等[11]發(fā)現(xiàn),0.5 μmol/L雙陽(yáng)離子卟啉XF-73孵育15 min用12 J/cm2的藍(lán)光照射即可使白色念珠浮游菌活力下降超過6個(gè)log，而對(duì)于生物膜，則必須用更高濃度的1 μmol/L XF-73孵育4 h結(jié)合48.2 J/cm2藍(lán)光才可以殺滅超過5個(gè)log的細(xì)胞。這與生物膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是密不可分的。生物膜代謝活性高，結(jié)構(gòu)致密，其內(nèi)靶細(xì)胞含量多，排列緊湊[10]。有學(xué)者建議重復(fù)應(yīng)用PDT，延長(zhǎng)孵育時(shí)間、光照時(shí)間及增加光敏劑的濃度可提高PDT對(duì)生物膜的抗菌活性[10,13]。Cernáková等[12]研究表明，PDT可以抑制對(duì)卡泊芬凈不敏感的近平滑念珠菌的生物膜生長(zhǎng)。另有研究者[13]發(fā)現(xiàn)，對(duì)耐藥菌的殺傷力與光劑量呈依賴性關(guān)系，研究者們推測(cè)耐藥性并不是一個(gè)影響PDT療效的因素，白色念珠菌的酵母型與菌絲狀兩種形態(tài)的比例可能起著關(guān)鍵作用。目前體外研究證實(shí)，PDT殺滅念珠菌的方式是多途徑、多位點(diǎn)的，對(duì)不同菌型及形態(tài)都具有明確的體外殺傷作用，同時(shí)對(duì)傳統(tǒng)抗真菌藥物不敏感或耐藥的念珠菌亦有較大的滅活力，然而PDT是否在機(jī)體環(huán)境下是否有著同樣效果仍需進(jìn)一步的動(dòng)物水平研究。

4 PDT抗念珠菌的動(dòng)物研究

念珠菌廣泛存在于人體的口腔、皮膚、黏膜等部位，一旦機(jī)體免疫系統(tǒng)失調(diào)念珠菌過度生長(zhǎng)則可導(dǎo)致不同的疾病。Carmello等[14]利用免疫功能抑制的小鼠誘導(dǎo)口腔念珠菌感染模型，以100 mg/L的二氫卟吩e6衍生物-Photodithazine?(PDZ)孵育20 min，在波長(zhǎng)660 nm，光照能量37.5 J/cm2的激光照射，與制霉菌素1 000 IU治療的作為陽(yáng)性對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療24 h后二者菌落失活較基線下降分別為3和3.2個(gè)log，7 d后PDT治療組較制霉菌素組患處治療效果明顯，達(dá)到了完全緩解。同時(shí)在試驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn)PDT對(duì)小鼠的炎癥介質(zhì)反應(yīng)有一定的影響。有學(xué)者[15]認(rèn)為這種由PDT引發(fā)的短暫性TNF-α升高預(yù)示著機(jī)體清除壞死細(xì)胞，加速了組織恢復(fù)。這與肉眼觀察到的PDT組的口腔炎癥的快速緩解趨勢(shì)相一致。PDT可以減輕念珠菌感染伴發(fā)的炎癥反應(yīng)，在小鼠其他部位感染的研究中同樣得到證實(shí)。Machado-de-Sena等[16]以1 mmol/L的MB配合紅光對(duì)感染白色念珠菌陰道炎的小鼠進(jìn)行PDT干預(yù)，不僅能有效減少念珠菌生長(zhǎng)的菌落數(shù)，而且經(jīng)過兩次PDT治療后感染處的炎性細(xì)胞明顯減低，這可能與第1次PDT治療后殘余的念珠菌毒力因子減少有關(guān)。女性陰道炎的臨床癥狀主要源自炎癥反應(yīng)本身而非真菌感染，光動(dòng)力殺滅真菌的同時(shí)能減輕炎癥反應(yīng)，這對(duì)于促進(jìn)PDT 進(jìn)一步應(yīng)用到臨床中十分有意義。動(dòng)物模型研究表明，PDT對(duì)口腔、皮膚、黏膜等不同部位的念珠菌感染均有較好的療效，并可能會(huì)減輕全身炎癥反應(yīng)，且對(duì)宿主組織細(xì)胞無(wú)損害作用，這為進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供了相對(duì)堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

5 PDT抗念珠菌的臨床研究

目前PDT抗念珠菌感染的研究多集中于體外及動(dòng)物水平階段，臨床試驗(yàn)的研究仍較少，文獻(xiàn)報(bào)道的臨床研究基本為念珠菌感染的口腔疾病。邱海霞等[17]研究表明PDT可以有效治療食管白色念珠菌感染。Scwingel等[18]發(fā)現(xiàn)，以MB為光敏劑的PDT能有效治療HIV感染者并發(fā)的口腔念珠病，比傳統(tǒng)抗真菌藥具有更長(zhǎng)效的滅菌力。研究顯示，從HIV感染者中分離得到的白色念珠菌株的蛋白酶、磷脂酶和黏附力等毒力因子較正常菌株的表達(dá)更強(qiáng)，而HIV感染者免疫系統(tǒng)缺陷也更容易造成念珠菌的反復(fù)感染，PDT多途徑的化學(xué)殺傷作用對(duì)于較強(qiáng)毒性念珠菌的反復(fù)感染似乎是一個(gè)很好的解決辦法。不過由于PDT一般采用局部用藥有可能也會(huì)因?yàn)榻佑|面不完全而影響后期的療效。Mima等[19]以Photogem?介導(dǎo)的PDT和制霉菌素治療念珠菌導(dǎo)致的義齒性口炎，有效率分別為45%和53%，研究者們推測(cè)PDT組中有效率較低的原因可能是因?yàn)轭a膜、舌背等口腔其他地方的白色念珠菌遷移到經(jīng)過PDT治療后的上顎部重新繁殖?，F(xiàn)有的臨床研究表明，經(jīng)過PDT治療的念珠菌感染復(fù)發(fā)率更低，不過臨床治愈率仍受諸多因素影響，目前臨床研究中應(yīng)用的光敏劑及濃度、治療時(shí)間和光照參數(shù)等都比較單一，而這些影響因素在體外研究對(duì)念珠菌的滅活力有著至關(guān)重要的作用，因此將來(lái)的臨床試驗(yàn)對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行更多的嘗試尋求最適當(dāng)?shù)腜DT參數(shù)條件對(duì)提高臨床治愈率十分必要。

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黃力毅(E-mail:liyi175@163.com)

2017-09-07)