衛(wèi)美蓉，施喜俠，劉晶，王笑峰

(1西京學(xué)院，西安710123；2西安高新醫(yī)院；3深圳市南山區(qū)第六人民醫(yī)院；4青島大學(xué))

胃癌患者Toll樣受體4基因rs10759932、rs11536889多態(tài)性觀察

衛(wèi)美蓉1，施喜俠2，劉晶3，王笑峰4

(1西京學(xué)院，西安710123；2西安高新醫(yī)院；3深圳市南山區(qū)第六人民醫(yī)院；4青島大學(xué))

目的觀察胃癌及EB病毒(EBV)陽性胃癌患者Toll樣受體4(TLR4)基因rs10759932、rs11536889多態(tài)性，探討其與胃癌和EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)易感性的關(guān)系。方法采用PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測160例胃癌患者[胃癌組，包括41例EBVaGC患者和119例EBV陰性(EBVnGC)患者]、100例健康體檢者(對照組)TLR4基因rs10759932、rs11536889位點多態(tài)性。結(jié)果①TLR4基因rs10759932位點多態(tài)性：胃癌組基因型TT者90例、TC者53例、CC者7例，等位基因T頻數(shù)233(77.7%)、等位基因C頻數(shù)67(22.3%)。對照組基因型TT者42例、TC者40例、CC者18例，等位基因T頻數(shù)124(62.0%)、等位基因C頻數(shù)76(38.0%)。胃癌組TT基因型頻率明顯高于對照組(χ2=14.373,P<0.01)。與攜帶CC基因型者相比，攜帶TT基因型者罹患胃癌的風(fēng)險增加(OR=5.510,95%CI為2.138～14.202，P<0.01)。胃癌組和對照組等位基因T、C頻率比較有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=14.423，P<0.01)。個體攜帶等位基因C可以降低罹患胃癌的風(fēng)險(OR=2.131,95%CI為1.437～3.161,P<0.01)。胃癌組EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。②TLR4基因rs11536889位點多態(tài)性：胃癌組和對照組、胃癌組EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。結(jié)論TLR4基因rs10759932位點多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)，攜帶C等位基因者罹患胃癌的風(fēng)險較低。TLR4基因rs11536889位點多態(tài)性與胃癌易感性無關(guān)。TLR4基因rs10759932、rs11536889位點多態(tài)性與胃癌是否合并EBV感染無關(guān)。

胃癌；EB病毒；Toll樣受體4；單核苷酸多態(tài)性

胃癌的發(fā)病過程極其復(fù)雜，是多步驟、多因素參與形成的。一方面是因為機體DNA長期暴露于不利的環(huán)境中導(dǎo)致DNA損傷，從而引發(fā)癌基因激活和(或)抑癌基因失活，最終促使腫瘤的形成[1]；另一方面原因為基因存在多態(tài)性，使得部分個體由于攜帶腫瘤易感基因，即使較少地暴露于危險環(huán)境因素下也發(fā)病[2]。在胃癌細胞中，Toll樣受體4(TLR4)呈現(xiàn)高表達，且對胃癌的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生重要影響[3]。EB病毒(EBV)在多種腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮促進作用，是一種重要的腫瘤相關(guān)病毒[4]。rs10759932、rs11536889是TLR4基因容易出現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性的位點。TLR4基因rs10759932、rs11536889多態(tài)性與胃癌及EBV相關(guān)胃癌(EBVaGC)易感性的關(guān)系目前尚不明確。2015年10月～2016年2月，本研究觀察了胃癌及EBVaGC患者TLR4基因rs10759932、rs11536889位點多態(tài)性，探討其與胃癌和EBVaGC易感性的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇EBVaGC患者41例為EBVaGC組，其中男22例、女19例，年齡41～76歲；臨床分期為Ⅰ期14例，Ⅱ期17例，Ⅲ期10例；病理分級為T1N06例，T1N18例，T1N26例，T2N16例，T3N05例，T2N2M010例。選擇EBV陰性胃癌(EBVnGC)患者153例為EBVnGC組，其中男81例、女72例，年齡39～74歲；臨床分期為Ⅰ期53例，Ⅱ期60例，Ⅲ期40例；病理分級為T1N021例，T1N132例，T1N226例，T2N114例，T3N020例，T2N2M040例。EBVaGC與EBVnGC患者在性別、年齡、臨床分期、病理分級等方面有可比性。將EBVaGC、EBVnGC組患者合并為胃癌組，另選取性別、年齡匹配的100例健康體檢者為對照組。排除感染、自身免疫病、腫瘤患者。入組者均來自山東地區(qū)漢族人群，且已簽署知情同意書。

1.2 TLR4基因多態(tài)性檢測方法 采用苯酚、氯仿-異戊醇抽提法提取所有受檢者胃癌組織及血液中的DNA，TE緩沖液(pH 8.0)溶解干燥后的DNA，并于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)檢測TLR4基因rs10759932、rs11536889多態(tài)性。① rs10759932位點。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中包括10×Buffer 2.5 μL，上下游引物(0.5 μmol/L)各1.25 μL，dNTPs (0.2 mmol/L)2.0 μL，DNA 模板3 μL，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR正向引物5′-TTTGTATAATTTGACTACCATTGCGT-3′，反向引物 5′- CATTTT-TTCACATCTTCACCAGC-3′。循環(huán)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃ 30 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠其中含溴化乙錠(0.5 μg/mL)中電泳，凝膠成像記錄電泳結(jié)果。PCR實驗中每次反應(yīng)均用無菌雙蒸水設(shè)立陰性對照。PCR擴增完成后，將5 μL PCR產(chǎn)物與0.5 μL限制性內(nèi)切酶HhaI混合并加入10×Buffer 2.5 μL及純水共25 μL混勻后瞬時離心，于37 ℃溫育15 min進行酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物用4.0%的聚丙乙烯垂直凝膠電泳分離，溴化乙錠染色后成像系統(tǒng)記錄電泳結(jié)果。GC↓GC序列為限制性內(nèi)切酶HhaI的識別部位。②rs11536889位點。兩對引物同時加入PCR反應(yīng)體系進行擴增，直接鑒定基因型[5]。PCR正向引物1序列5′-TTTGATGGACCTCTGAATCTC-3′，反向引物1序列 5′-TTTTCTCAATGATAACATCCACTC-3′；PCR正向引物2序列5′- CTTGACCACATTTTGGGAAC-3′，反向引物2序列5′-TTCCAATTTCTCTATATCCTTGATGA-3′。該位點的PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件和TLR4 rs10759932位點相同。PCR反應(yīng)完成后，利用2.5% 瓊脂糖凝膠電泳分離12 μL PCR產(chǎn)物，用溴化乙錠染色后凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄實驗結(jié)果。

將25 μL PCR產(chǎn)物送華大基因有限公司采用末端終止法進行雙向測序。測序結(jié)果用DNAStar(Larsergene7.0)及Chromas軟件進行分析處理，并查找基因庫中野生型TLRs相應(yīng)的基因序列，與測序結(jié)果進行對比，對PCR-RFLP鑒定結(jié)果進一步驗證。rs10759932位點：PCR產(chǎn)物酶切后電泳得到一條139 bp條帶者為純合野生基因型TT，得到117、22 bp兩條帶者為突變基因型CC，得到117、22、139 bp三條帶者為雜合基因型TC。基因測序結(jié)果與上述判斷相符。rs11536889位點：PCR產(chǎn)物酶切后電泳得到397、184 bp兩條條帶者為純合子野生基因型GG，得到397、256 bp兩條條帶者為純合突變基因型CC，得到397、256、184 bp三條擴增條帶者為雜合基因型GC。基因測序結(jié)果證實上述判斷。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。采用χ2檢驗或Fisher檢驗比較胃癌組與對照組、EBVnGC與EBVaGC患者基因型及等位基因頻率的分布，并計算比值比(OR)及P值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有受檢者中TLR4基因rs10759932、rs11536889基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡。

2.1 TLR4基因rs10759932位點多態(tài)性與胃癌及EBV感染的關(guān)系 胃癌組基因型TT者90例、TC者53例、CC者7例，等位基因T頻數(shù)233(77.7%)、等位基因C頻數(shù)67(22.3%)。對照組基因型TT者42例、TC者40例、CC者18例，等位基因T頻數(shù)124(62.0%)、等位基因C頻數(shù)76(38.0%)。胃癌組TT基因型頻率明顯高于對照組(χ2=14.373,P<0.01)。與攜帶CC基因型者相比，攜帶TT基因型者罹患胃癌的風(fēng)險增加(OR=5.510,95%CI為2.138～14.202，P<0.01)。胃癌組和對照組等位基因T、C頻率比較有統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=14.423，P<0.01)。個體攜帶等位基因C可以降低罹患胃癌的風(fēng)險(OR=2.131,95%CI為1.437～3.161,P<0.01)。胃癌組EBVaGC患者基因型TT者19例、TC者18例、CC者3例，等位基因T頻數(shù)56(70.0%)、等位基因C頻數(shù)24(30.0%)；EBVnGC患者基因型TT者71例、TC者35例、CC者4例，等位基因T頻數(shù)177(80.5%)、等位基因C頻數(shù)43(19.5%)。EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。

2.2 TLR4基因rs11536889位點多態(tài)性與胃癌及EBV感染的關(guān)系 胃癌組基因型為GG者95例、GC者54例、CC者4例，等位基因G頻數(shù)244(79.7%)、C頻數(shù)62(20.3%)。對照組基因型為GG者64例、GC者34例、CC者2例，等位基因G頻數(shù)162(81.0%)、C頻數(shù)38(19.0%)。兩組基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。胃癌組EBVaGC患者基因型GG者23例、GC者18例、CC者2例，等位基因G頻數(shù)64(74.4%)、等位基因C頻數(shù)22(25.6%)；EBVnGC患者基因型GG者72例、GC者36例、CC者2例，等位基因G頻數(shù)180(81.8%)、等位基因C頻數(shù)40(18.2%)。EBVaGC和EBVnGC患者基因型和等位基因分布相比，P均>0.05。

3 討論

研究表明，TLRs基因某些位點多態(tài)性與腫瘤的遺傳易感性、臨床分期及患者預(yù)后密切相關(guān)[6]。其中包括位于9號染色體上，其cDNA全長為3 811 bp，包含4個外顯子的TLR4基因。大量有關(guān)TLR4基因多態(tài)性的研究結(jié)果表明，其各位點的多態(tài)性可能與腫瘤的易感性有關(guān)[7～9]。例如，Garza-Gonzalez等[10]研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因多態(tài)性(Asp299Gly、Thr399Ile)可能會導(dǎo)致持久的炎癥，導(dǎo)致其攜帶者癌癥的易感性明顯增加；Hishida等[11]發(fā)現(xiàn)TLR4 rs11536889基因的多態(tài)性可以增加幽門螺桿菌陽性胃癌的易感性；Huang等[12]研究結(jié)果顯示TLR4 rs10759932位點基因的多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)；還有研究發(fā)現(xiàn)TLR4基因rs11536889多態(tài)性和前列腺癌的易感性相關(guān)[13]。這些研究結(jié)果均說明人類一些炎癥、惡性腫瘤的易感性可能與TLR4基因多態(tài)性之間存在某種聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，TLR4基因rs10759932位點多態(tài)性與胃癌易感性有關(guān)，攜帶C等位基因者罹患胃癌的風(fēng)險較低。此結(jié)果與Huang等[12]的研究結(jié)論一致。然而本研究結(jié)果顯示，TLR4基因rs11536889位點多態(tài)性與胃癌易感性無相關(guān)性。之前有關(guān)該位點多態(tài)性的研究結(jié)果也有相同結(jié)論，例如Zhang等[14]報道TLR4基因rs11536889位點多態(tài)性與罹患胃癌的易感性無相關(guān)性。rs11536889位點位于TLR4基因的中心部位，因此該位點的多態(tài)性可能影響造成其mRNA的不穩(wěn)定。有研究結(jié)果顯示，在華人中攜帶等位基因C可以明顯增加胃癌的易感性，但是在其他亞洲人和高加索人群中的相同研究卻得出不同的結(jié)論[15]。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)該位點的多態(tài)性不僅與胃部腫瘤有關(guān)，而且與其他的一些炎癥相關(guān)性腫瘤關(guān)系密切[16]。以上研究結(jié)論均提示基因多態(tài)性只是有關(guān)胃癌易感性的眾多風(fēng)險因素中的一個。

慢性炎癥、免疫抑制或免疫刺激等因素均可以促進EBV活化和復(fù)制。微生物的內(nèi)源性損傷相關(guān)模式分子和病原相關(guān)分子模式可通過刺激TLRs，從而激活免疫系統(tǒng)，進一步促進EBV陽性細胞的擴增[17]。研究證實在某些疾病發(fā)展過程中TLRs與EBV可以相互作用[18]。Yang等[19]發(fā)現(xiàn)TLR4基因T399I，其攜帶CT/TT基因型的人群罹患鼻咽癌的風(fēng)險較高。然而本研究結(jié)果則顯示，TLR4 rs11536889、rs10759932位點基因的多態(tài)性與EBV感染無相關(guān)性。這可能是由于EBVaGC組織中EBV編碼基因的表達與其他EBV相關(guān)腫瘤例如鼻咽癌、Burkitt′s淋巴瘤等有一定的差異。有研究發(fā)現(xiàn)TLRs中部分成員通過激活LMP1而產(chǎn)生相關(guān)細胞因子，調(diào)節(jié)一系列相關(guān)基因的表達，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。已有研究表明在EBVaGC組織中檢測不到EBV細胞轉(zhuǎn)化基因即潛伏膜蛋白(LMP1)，證明其編碼基因是不能夠表達的。這是因為EBV以Ⅰ型潛伏的形式存于EBVaGC中，即不能夠表達LMP1。研究也進一步證明了EBVaGC具有其獨特性，同時也提示TLRs基因多態(tài)性在EBVaGC中所發(fā)揮的作用與其在其他腫瘤組織中所發(fā)揮的作用是存在一定差異的。

總之，本次試驗結(jié)果證明了TLR4 rs10759932位點的多態(tài)性與胃癌易感性有密切的關(guān)系，然而rs11536889位點的多態(tài)性與胃癌易感性無關(guān)。且TLR4基因 rs10759932、rs11536889位點多態(tài)性與EBV感染無關(guān)。但是本研究仍存在樣本量較小等缺陷。因此我們應(yīng)擴大EBVaGC樣本量，增加慢性胃部炎癥患者作為病例對照，且對TLR4編碼基因的其他多態(tài)性位點進行檢測，同時結(jié)合外界環(huán)境因素和宿主因素對胃癌形成的影響，進一步明確TLR4 基因多態(tài)性與胃癌以及EBV感染是否具有協(xié)同作用。

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施喜俠(E-mail: 13569535@qq.com)

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1002-266X(2017)40-0063-04

2017-05-12)