張業(yè)翠，吳鵬，武文，郭興瑩，王艷青，黃象艷

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院， 濟(jì)南 250031)

ABO正反定型不符患者血型的血清學(xué)及基因測序鑒定(附1例報(bào)告)

張業(yè)翠，吳鵬，武文，郭興瑩，王艷青，黃象艷

(濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院， 濟(jì)南 250031)

目的對1例ABO正反定型不符患者血型進(jìn)行血清學(xué)及基因測序鑒定。方法選擇1例標(biāo)準(zhǔn)血型血清學(xué)方法(微柱凝膠卡+全自動血型配血分析儀)鑒定結(jié)果為ABO正反定型不符(正定型為O型，反定型為A型)患者，抽取其血液標(biāo)本，采用試管法做進(jìn)一步的血清學(xué)鑒定，包括正反定型復(fù)查、紅細(xì)胞吸收放散試驗(yàn)；提取血液基因組DNA，采用PCR法擴(kuò)增ABO基因第6、7外顯子并測序。結(jié)果試管法血清學(xué)表現(xiàn)為ABO血型正反定型不一致,正定型未檢測到A抗原和B抗原,反定型血清中存在抗-B及弱的抗-A；紅細(xì)胞做吸收放散試驗(yàn)檢出A抗原，初定為A亞型。測序結(jié)果與A101參考序列相比較，發(fā)現(xiàn)Ax13亞型940位堿基A>G的亞型決定性基因突變。結(jié)論本例患者ABO血型疑似A亞型，ABO基因型為Ax13/O01，第七外顯子940位A>G突變導(dǎo)致A抗原表達(dá)減弱。

ABO血型；Ax13亞型；基因測序；基因突變

血型是指血液成分(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板)表面的抗原類型，是血液中各種成分的遺傳多態(tài)性標(biāo)志，通常所說的血型是指紅細(xì)胞膜上特異性抗原類型。國際輸血學(xué)會已經(jīng)在人類中正式報(bào)告了屬于36個(gè)血型系統(tǒng)的300多種紅細(xì)胞抗原[1]。ABO血型是臨床輸血醫(yī)學(xué)中最重要的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)之一，涉及臨床安全輸血、器官移植、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)等領(lǐng)域[2]。ABO血型系統(tǒng)除正常的 A、B、O、AB這4 種血型外，還具有多個(gè)亞型，表現(xiàn)為抗原明顯減弱或正反定型不一致。ABO亞型的主要發(fā)生原因是ABO基因編碼區(qū)的突變，包含點(diǎn)突變、缺失突變等[3]。對于常規(guī)血清學(xué)檢測不能確定的血型，應(yīng)該行ABO基因測序分型。本研究采用標(biāo)準(zhǔn)血清學(xué)鑒定和ABO基因測序的方法鑒定1例血清學(xué)實(shí)驗(yàn)正反定型不符的疑難血型標(biāo)本，并分析Ax亞型的血清學(xué)特征和基因序列特征?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患者男，34歲。體外受精術(shù)前采用標(biāo)準(zhǔn)血型血清學(xué)方法(微柱凝膠卡+全自動血型配血分析儀)鑒定血型，結(jié)果為ABO正反定型不符(正定型為O型，反定型為A型)。本研究已獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)?；颊邔Ρ狙芯恐橥馇乙呀?jīng)簽署知情同意書。

1.2 ABO血型血清學(xué)鑒定方法 ①試管法ABO正反定型[4]：取潔凈小試管6只，標(biāo)明抗-A、抗-B、AC、BC、OC、自身C，標(biāo)記有抗-A、抗-B字樣的小試管分別加入抗A、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清各1滴及被檢者5%三洗紅細(xì)胞生理鹽水懸液各1滴；標(biāo)記有AC、BC、OC字樣的小試管分別加入相應(yīng)的5%試劑ABO細(xì)胞各1滴及被檢者血清各2滴，標(biāo)記有自身C字樣的小試管加入被檢者5%三洗紅細(xì)胞生理鹽水懸液l滴及血清2滴，以上各管均充分混勻，放入血型血清學(xué)專用離心機(jī)以1 000×g離心15 s，判讀結(jié)果。②紅細(xì)胞吸收和放散試驗(yàn)：取患者三洗壓積紅細(xì)胞1 mL，加等量單克隆抗-A試劑混勻，置于4 ℃環(huán)境中吸收1 h ，然后用冷鹽水洗滌8次，再加等量常溫的生理鹽水混勻，放入56 ℃熱放散10 min后離心取放散液。用低離子抗人球卡將放散液與A試劑紅細(xì)胞反應(yīng)，并將最后一次離心洗滌后的上清液作為平行對照，孵育離心觀察結(jié)果。

1.3 ABO基因測序方法 抽取患者外周靜脈血2 mL置于EDTA抗凝管中, 使用TIANamp血液DNA提取試劑盒, 按步驟提取全血DNA，用外顯子6、7擴(kuò)增試劑盒和PCR法擴(kuò)增ABO基因外顯子6和7，將PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程公司進(jìn)行直接測序。將測序結(jié)果與紅細(xì)胞基因序列數(shù)據(jù)庫中的ABO等位基因進(jìn)行比對，確定亞型。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)鑒定結(jié)果 試管法復(fù)查血型，室溫條件下結(jié)果與微柱凝膠法結(jié)果一致。正定型患者紅細(xì)胞與抗-A、抗-B標(biāo)準(zhǔn)血清均無凝集；與抗-AB反應(yīng)凝集強(qiáng)度為++；與抗H反應(yīng)凝集強(qiáng)度為++++；反定型患者血清與標(biāo)準(zhǔn)反定細(xì)胞AC、OC均無凝集，與BC凝集強(qiáng)度為++++，自身對照為陰性。反定型放4 ℃ 10 min后立即離心，結(jié)果顯示血清中除檢出有較強(qiáng)的抗-B外，還檢出弱的抗-A(凝集強(qiáng)度為+/-)；4 ℃ 30 min后再次離心抗-A凝集強(qiáng)度較前有所增強(qiáng)(凝集強(qiáng)度為++)。血清學(xué)格局呈現(xiàn)A亞型。吸收放散試驗(yàn)放散液與A試劑紅細(xì)胞呈陽性反應(yīng)，最后一次離心洗滌后的上清液與A試劑紅細(xì)胞呈陰性反應(yīng)。

2.2 基因測序結(jié)果 外顯子6存在261位缺失突變，為O01型一般性特征性突變；外顯子7出現(xiàn)第940位A>G突變，為Axl3亞型決定性突變。結(jié)合外顯子6和外顯子7測序結(jié)果，確定受檢標(biāo)本的基因型為Axl3/O01。

3 討論

正確的血型鑒定是保證臨床輸血安全的關(guān)鍵。因此，如何正確鑒定常規(guī)血清學(xué)檢測中正反定型不符的血型標(biāo)本至關(guān)重要。ABO亞型是引起血型正反定型不符的常見原因之一，其判定標(biāo)準(zhǔn)往往是根據(jù)紅細(xì)胞和抗體反應(yīng)強(qiáng)度、H抗原強(qiáng)度、吸收放散能力等進(jìn)行[5]。本研究該例患者血清學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示為A亞型，血清學(xué)檢測結(jié)果顯示為疑似Ael亞型或Ax亞型。Ax亞型是ABO亞型中一種弱表現(xiàn)型，Ax表現(xiàn)型具有高度的遺傳異質(zhì)性，其主要血清學(xué)特征是: Ax亞型紅細(xì)胞與來源于B型個(gè)體血清中的抗-A呈弱凝集反應(yīng)或不凝集，與來源于O型個(gè)體血清中抗-AB的反應(yīng)增強(qiáng)，血清中常含有弱的抗-A，與抗-H的凝集強(qiáng)度都近似于O型，顯示強(qiáng)凝集[6，7]。Ax亞型與Ael亞型有相似之處，Ael 亞型是另一種較為罕見的ABO亞型，其紅細(xì)胞通常條件下與抗-A、抗-AB血清試劑不發(fā)生凝集，H抗原的含量比B型紅細(xì)胞高，接近O型紅細(xì)胞，A抗原表達(dá)量極弱，往往需要通過吸收放散試驗(yàn)才能檢出[8，9]。本研究中該例患者血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示紅細(xì)胞與抗AB凝集++，與抗H凝集++++，經(jīng)吸收放散試驗(yàn)檢出A抗原；反定型在4 ℃10 min檢出較強(qiáng)的抗-B及弱的抗-A，4 ℃ 30 min后抗-A凝集強(qiáng)度較前有所增強(qiáng)凝集強(qiáng)度為++，推測該血型可能為Ax亞型。由于Ax亞型與Ael亞型之間只表現(xiàn)為極少的血型血清學(xué)差異,為進(jìn)一步確定該患者亞型，我們對ABO基因進(jìn)行測序以確定其亞型。

ABO血型系統(tǒng)基因位于9號染色體，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，其中ABO基因型多態(tài)性集中在6、7外顯子片段。所以我們對ABO基因第 6、7 外顯子和第6 內(nèi)含子的核苷酸序列進(jìn)行了測序。結(jié)果顯示，外顯子6存在261位缺失突變，為O01型一般性特征性突變；外顯子7出現(xiàn)第940位A>G突變，經(jīng)檢索國際血型抗原突變庫，940位A>G突變基因?yàn)锳xl3[10]，940位堿基突變只有在Axl3等位基因中發(fā)現(xiàn)。α1，3-N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶基因940位A>G突變使314位賴氨酸變成谷氨酸，進(jìn)而導(dǎo)致A抗原表達(dá)減弱。自從1993年報(bào)道了世界首例Ax等位基因[11]以來，在不同地區(qū)和人群中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)25個(gè)Ax等位基因，Cai等[12]在2013年報(bào)道了Axl3等位基因。突變導(dǎo)致的A抗原弱表達(dá)易使弱A錯判為O型，造成血型鑒定錯誤。

血型鑒定在輸血工作中占有極其重要的地位，是輸血治療的首要步驟。除此之外，ABO血型在心血管疾病中的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性研究[13]和與腫瘤患者預(yù)后相關(guān)性的研究[14]也越來越受到關(guān)注。因此，血型鑒定的準(zhǔn)確與否是臨床輸血安全和其他臨床相關(guān)研究最為關(guān)鍵的一步。除了常見的典型ABO表型外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多ABO亞型在紅細(xì)胞上具有弱表達(dá)的A或B抗原，這使得血型分型越來越困難，往往呈現(xiàn)ABO正反定型不一致。遇到ABO正反定型不符的標(biāo)本，首先需要通過重新采集血樣和重復(fù)規(guī)范操作來排除操作不規(guī)范等因素的影響，然后需要通過實(shí)驗(yàn)排除弱抗原和(或)弱抗體的漏檢，找到科學(xué)合理的解釋，最終通過血清學(xué)特征初步判定血型。

血清學(xué)方法是血型鑒定的經(jīng)典方法，適用于日常的血型定型工作。當(dāng)遇到血型正反定型不一致時(shí)，可以通過敏感的吸收放散試驗(yàn)和血型物質(zhì)檢測證實(shí)抗原的存在，通過4 ℃加強(qiáng)試驗(yàn)證實(shí)抗體。當(dāng)然，在亞型鑒定時(shí)僅采用血清學(xué)方法鑒定是有一定局限性的，同樣是A亞型，在基因測序時(shí)就有可能會出現(xiàn)Ax、Ael等不同的基因型或同一亞型的不同分型。基因測序可以對患者血型進(jìn)行基因分型，并有可能發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)、探討疑難血型的發(fā)生機(jī)制，是對血清學(xué)鑒定方法的有效且重要的補(bǔ)充[10]。因此，在血型鑒定工作中將兩種方法有效結(jié)合，對于正確鑒定疑難血型和保證臨床安全輸血具有重要意義。

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黃象艷(E-mail： xiangyan73@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.40.013

R446.6

B

1002-266X(2017)40-0048-03

2017-04-30)