路宏朝++張濤++王令

摘要：以18日胚齡及6、180日齡黃羽雞和略陽烏雞為研究對象，探討不同發(fā)育時期肌肉中風味物質(zhì)的形成規(guī)律。[JP2]采用高效液相色譜儀測定腿肌和胸肌中的肌苷酸含量，利用熒光定量PCR方法檢測肌苷酸合成關鍵酶腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）基因的mRNA表達情況。結果顯示：黃羽雞和略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達、肌苷酸的含量均在6日齡時最高，胸肌中肌苷酸在180日齡時含量最高，表達趨勢基本一致；略陽烏雞腿肌和胸肌的肌苷酸含量在180日齡時明顯高于黃羽雞。同時，ADSL基因的表達量在不同時期均明顯高于黃羽雞，表明成年略陽烏雞的肉品質(zhì)優(yōu)于黃羽雞。

關鍵詞：略陽烏雞；肉品質(zhì)；肌苷酸；腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）

中圖分類號： S831.1文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0277-03

收稿日期：2015-10-12

基金項目：陜西省科技廳農(nóng)業(yè)攻關項目（編號：2013K02-26-02）；陜西省教育廳項目（編號：12JS028）。

作者簡介：路宏朝（1980—），女，陜西勉縣人，碩士，副教授，主要從事動物生理學研究。E-mail：zl780823@sina.com。

多年來，肉用家禽的選育主要側重于生長速度和肌肉產(chǎn)量2個方面，隨著家禽育種技術的發(fā)展和應用，飼養(yǎng)1羽體質(zhì)量為1.8 kg的肉雞僅需5周的生產(chǎn)時間。然而，家禽快速生長的同時也引發(fā)了骨骼形態(tài)異常、胴體品質(zhì)下降等一系列問題，且深加工后的肉品質(zhì)正隨著生產(chǎn)性能的提高而逐步下降[1]。大量研究表明，鮮味是評價肉品質(zhì)的重要指標之一，而肌苷酸（inosinic acid，IMP）是決定畜禽肉質(zhì)鮮味的主要物質(zhì)[2-3]。IMP和糖蛋白在水和脂肪中加熱會產(chǎn)生明顯的肉鮮味，與谷氨酸鈉具有協(xié)同鮮味作用。肌苷酸已成為肉質(zhì)評定的重要指標，被廣泛應用于各種動物肉類產(chǎn)品的品質(zhì)評定，其含量高低間接反映出肉類食品風味的優(yōu)劣[4-5]。腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinate yase，ADSL）是肌苷酸合成過程中的關鍵酶之一。張學余等研究發(fā)現(xiàn)，ADSL基因對雞的肌肉肌苷酸含量可產(chǎn)生一定影響[6]。

略陽烏雞是陜西省的優(yōu)良地方雞種之一，產(chǎn)于略陽縣黑河流域。略陽烏雞的體型大小位居全國四大烏雞之首，具有“六端烏”（烏皮、烏喙、烏腿、烏趾、烏舌、烏冠）、屠宰率高、蛋大微綠、肉用性能較好、兼具藥用價值等優(yōu)點，被譽為“禽中明珠”[7]。本研究采用高效液相色譜法，測定不同發(fā)育時期略陽烏雞和黃羽雞肌肉樣中的肌苷酸含量，并運用實時熒光定量PCR技術分析肌苷酸的關鍵合成酶——腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）的基因相對表達情況，初步探討略陽烏雞在不同發(fā)育時期ADSL和肌苷酸的分布規(guī)律，為雞肌肉肌苷酸含量與肌苷酸合成關鍵酶之間關系的進一步研究奠定基礎，并為從分子水平闡明略陽烏雞的特異鮮味機理提供基礎數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗動物

將數(shù)枚黃羽雞和略陽烏雞種蛋置于全自動孵化機中孵化，分別取8、18日胚齡及6、180日齡黃羽雞和略陽烏雞的腿肌、胸肌，于-80 ℃下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑

肌苷酸標準品（上海倍卓生物科技有限公司，純度為98%），甲醇（色譜純），甲酸銨（分析純），高氯酸（分析純，含量為70%～72%）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器

微電腦全自動孵化機，超純水機，電熱鼓風干燥箱，高速離心機，數(shù)顯分散均質(zhì)機，Waters 2695 Alliance型高效液相色譜儀，Waters 2487型紫外檢測儀，核酸定量儀（Thermo Fisher公司），熒光定量PCR儀（ABI公司）。

1.4試驗方法

1.4.150 mmol/L、pH值6.5甲酸銨緩沖溶液（流動相）的配制

稱取3.15 g甲酸銨于1 000 mL大燒杯中，加入500 mL超純水，采用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液將其pH值調(diào)至6.5，定容至1 000 mL。使用前采用0.45 μm濾膜過濾。

1.4.20.1 mg/mL肌苷酸標準儲備液

準確稱取1 mg肌苷酸標準品，采用5%甲醇水溶液定容至10 mL，搖勻。分別取上述儲備液10、20、30、40 μL配制濃度為10、20、30、40 ng/mL的肌苷酸標準工作液，采用5%甲醇水溶液定容至1 mL，搖勻。于使用前配制。

1.4.3樣品處理

分別稱取5 g胸肌、腿肌肌肉樣品，置于干凈器皿中并搗碎，加入20 mL 6%高氯酸，采用分散均質(zhì)機勻漿。以 4 000 r/min 離心15 min，收集上清；沉淀物再次加入15 mL 6%高氯酸，勻漿并離心，合并2次上清液即為提取液。提取液再經(jīng)離心，棄去沉淀物，采用配置好的NaOH溶液將提取液的pH值調(diào)整至6.5，采用水定容至100 mL，搖勻。測定前采用0.45 μm濾膜過濾，色譜經(jīng)流動相平衡30 min后，取標準液及樣品提取液利用色譜儀進行分析。

1.4.4色譜條件

色譜柱：Waters AtlantisTM dC18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動相：50 mmol/L、pH值6.5甲酸銨緩沖溶液（含5%甲醇）。流速1 mL/min、進樣量 2 mL、紫外檢測波長 254 nm，柱溫為室溫。標準工作液、樣品提取液的運行時間均為5 min。

1.4.5RNA提取與Real-time熒光定量PCR檢測

取不同日齡略陽烏雞的腿肌組織樣50～100 mg，在液氮預冷的研缽中研磨至粉末狀，期間須不斷補充液氮；加入 500 μL Trizol Reagent，搖勻后靜置5 min，于4 ℃、12 000 r/min 下離心 10 min，取上清；加入0.1 mL氯仿，劇烈振蕩15 s，靜置5 min，于4 ℃、12 000 r/min下離心15 min，取上清；加入等體積異丙醇，輕輕搖勻后靜置10 min，于4 ℃、12 000 r/min 下離心10 min，棄上清；采用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，于4 ℃、12 000 r/min下離心10 min，棄上清；室溫干燥，加入50 μL無RNase水，使RNA充分溶解，并檢測其濃度。按照RT-PCR System反應體系試劑盒（TaKaRa公司）的要求，將所提取的RNA樣品反轉錄為cDNA。

采用普通PCR檢測cDNA純度，反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取5 μL產(chǎn)物進行1%瓊脂凝膠電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結果。

采用Real-time熒光定量PCR檢測ADSL基因的表達情況。以雞的β-actin為內(nèi)參基因，20 μL擴增體系為：SYBRⅡ（TaKaRa公司）10 μL、Primer F/R 3.2 μL、cDNA 2 μL、H2O 4.8 μL，引物序列見表1。反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性10 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環(huán)。

2結果與分析

2.1標準曲線及線性范圍

將0.1 mg/mL肌苷酸標準儲備液分別配制為1、2、3、4 μg/mL 肌苷酸標準工作液，按“1.4.4”節(jié)設定色譜條件進行色譜分析，以肌苷酸濃度為自變量（x），以相應的色譜峰面積響應值為因變量（y）建立標準曲線方程。結果表明，在2～4 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，肌苷酸濃度與峰面積響應值之間具有良好的線性關系?；貧w方程為y=43.816 9x-304.292，相關系數(shù)r=0.999 671，r2=0.999 342。標準曲線分布見圖1。

[FK（W10][TPLHC1.tif]

2.2肌苷酸標準品與樣品的色譜對比分析

與以往研究不同，本試驗采用甲酸銨緩沖液作為流動相測定了樣品中肌苷酸的含量。由標準樣品的高效液相色譜（圖2）可知，肌苷酸標準品的出峰時間為0.75 min，各肌肉組織樣品與其他組分的色譜峰之間達到了較好的分離，其中與標準品出峰時間較為接近的是0.75 min的峰形。檢測所有樣品發(fā)現(xiàn)，色譜峰保留時間均為0.75～0.77 min，因此可確定為肌苷酸的峰形（圖3、圖4）。

2.3不同樣品肌苷酸的含量

分別取黃羽雞和略陽烏雞18日胚齡、6日齡、180日齡的胸肌和腿肌樣品，制備樣品溶液，采用“1.4.4”節(jié)的色譜條件進行分析，以峰面積套用圖1的回歸方程計算樣品中肌苷酸的含量（表2）。結果表明：與180日胚齡相比，黃羽雞6日齡的腿肌中肌苷酸含量最高（P<0.01），180日齡時下降至最低（P<0.01）；略陽烏雞6日齡的腿肌中肌苷酸含量最高，180日齡時有所降低，但仍明顯高于18日胚齡。2個雞種胸肌中的肌苷酸含量均在180日齡達到最高。略陽烏雞18日胚齡、6日齡時腿肌和胸肌中的肌苷酸含量與黃羽雞均沒有顯著差

[FK（W8][HT6H][JZ（]表2樣品中肌苷酸的含量[JZ）][HTSS]

[HJ*5][BG（！][BHDFG3，WK12，WK48W]年齡[ZB（][BHDWG1*2，WK24。2W]黃羽雞肌苷酸含量（mg/100 g）略陽烏雞肌苷酸含量（mg/100 g）

[BHDWG1*2，WK12。4W][XXZSX*2-ZSX23*2]腿肌胸肌[XXZSX*2-ZSX23*2]腿肌胸肌[ZB）W]

[BHDG1*2，WK12。5DWW]18日胚齡519.82±88.16589.67±63.30

[BHDW]6日齡934.60±115.94aa467.88±110.391 057.04±136.62aa396.00±55.23

[BH]180日齡315.15±69.55aa1 017.22±62.91921.71±100.18aabb1 481.76±79.88bb[BG）F]

注：與各組18日胚齡相比較，“a”“aa”分別表示在0.05、0.01水平下差異顯著；與黃羽雞組中不同日齡的腿肌和胸肌相比較，“b”“bb”分別表示在0.05、0.01水平下差異顯著。

異；略陽烏雞180日齡時腿肌和胸肌中的肌苷酸含量明顯高于黃羽雞，差異極顯著（P<0.01）。

2.4不同日齡黃羽雞和略陽烏雞腿肌組織中ADSL基因的mRNA表達水平

分別取8日胚齡、18日胚齡、6日齡、180日齡黃羽雞和略陽烏雞的腿肌組織提取RNA，采用Real-time熒光定量PCR檢測ADSL基因的mRNA表達情況。結果表明：ADSL基因的表達隨著日齡的增加呈上升趨勢，2個雞種腿肌中ADSL基因的表達水平均在6日齡達到最高，然后逐漸下降；在18日胚齡、6日齡、180日齡階段，略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達均明顯高于黃羽雞（圖5）。

[TPLHC5.tif]

3結論與討論

肌苷酸（IMP）與畜禽肉類食品鮮味的產(chǎn)生密切相關[3，8]，國內(nèi)外學者對雞、豬、魚等動物肌肉中的IMP開展了大量研究，目前世界上大多數(shù)國家均以肌苷酸含量作為評價肉類新鮮程度的指標之一。烏骨雞具有烏皮、烏肉、烏骨等特征，是我國傳統(tǒng)的藥食兼用雞種。陳國宏等對相同地方雞種肌肉中的肌苷酸含量進行比較研究，發(fā)現(xiàn)泰和烏骨雞的肌苷酸含量很高，此結論從客觀上提示了烏骨雞鮮味優(yōu)于其他雞種[9]。王翠麗等研究發(fā)現(xiàn)，川南烏骨雞中肌苷酸等風味物質(zhì)含量豐富[10]。目前，對于陜西略陽烏雞不同發(fā)育期肌肉中的肌苷酸含量尚無系統(tǒng)報道。

大量研究表明，肌苷酸的測定方法較多，但均存在一定缺陷。紫外分光光度法僅用于粗略定量；毛細管電泳法的分離度偏低，導致肌苷和腺苷單磷酸等相似物質(zhì)引起干擾；薄層層析法的操作步驟復雜，整個過程耗時多且回收率低。高效液相色譜法是一種高效、快速、高選擇性、高靈敏度的新型分離分析技術，樣品分析程序簡單快速，測定結果精確[11]。本研究采用高效液相法進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)樣品的色譜峰保留時間大多為0.75～0.77 min，與標準品出峰時間基本一致，同時樣品中其他組分的色譜峰之間也達到了較好的分離效果。本試驗采用甲酸銨為流動相，作為水溶性弱酸鹽，其有利于延長色譜柱的使用壽命，從而可用于大量樣品的測定。

本研究檢測了黃羽雞和略陽烏雞發(fā)育期3個時間點的肌苷酸含量。結果表明，黃羽雞和略陽烏雞的腿肌均在6日齡時肌苷酸含量最高，胸肌則在180日齡時肌苷酸含量最高。隨著日齡的增加，腿肌中的風味物質(zhì)在幼年時達到最高，然后逐漸降低；而胸肌中的風味物質(zhì)卻逐漸增多，表明胸肌中肌苷酸的合成主要發(fā)生在成年后。比較2個雞種發(fā)現(xiàn)，略陽烏雞180日齡時腿肌和胸肌的肌苷酸含量均明顯高于黃羽雞，但其余時間段差異不顯著。對于不同雞種，肌肉發(fā)育早期肌苷酸的合成沒有顯著差異，但成年后略陽烏雞肌肉中肌苷酸的合成量明顯多于黃羽雞，因此成年略陽烏雞的肉品質(zhì)優(yōu)于黃羽雞。

肌苷酸在體內(nèi)的合成代謝過程十分復雜，從頭合成涉及10步反應，腺苷琥珀酸裂解酶（ADSL）是催化第8步反應的酶，也是IMP合成酶系中催化合成嘌呤核苷酸起始合成與循環(huán)的唯一雙功能酶[6，12]。該酶催化2個重要的反應，由氨基咪唑琥珀基氨甲酰核苷酸生成氨基咪唑氨甲酰核苷酸的反應（由SACIAR生成AICAR的反應），以及由腺苷酸琥珀酸生成腺苷酸單磷酸的反應，這2個反應對于肌肉中肌苷酸的最終含量具有重要影響，因此ADSL基因也成為畜禽肉品鮮味研究的候選基因[12]。本研究對不同發(fā)育時期黃羽雞和略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達進行了檢測，結果表明：對于不同雞種ADSL基因的表達趨勢基本一致，表達量均在6日齡時最高；進一步比較不同日齡黃羽雞和略陽烏雞發(fā)現(xiàn)，略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達量在不同時期均明顯高于黃羽雞。這與高效液相色譜檢測肌苷酸含量的結果基本一致，表明ADSL基因的表達促進了肌苷酸的合成。但也存在一定區(qū)別，略陽烏雞腿肌中ADSL基因的表達量在不同發(fā)育時期均明顯高于黃羽雞，經(jīng)高效液相檢測，僅180日齡時腿肌中的肌苷酸含量明顯高于黃羽雞。這是由于肌苷酸的合成涉及10種關鍵酶，ADSL是關鍵酶之一但不是唯一酶。對于不同雞種，不同發(fā)育時期參與肌苷酸合成的關鍵酶表達的時空性也不同，從而導致肌苷酸的合成量表現(xiàn)出明顯差異。成年略陽烏雞肌肉中的肌苷酸含量顯著高于黃羽雞，但不同雞種間參與肌苷酸合成的其他酶的關鍵作用尚有待進一步研究。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻：[HT8.SS]

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