李文龍+潘建超+薛東升+劉紹勇+瞿海斌

[摘要]為辨識痰熱清注射液配液過程中影響最終產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵因素，采集了24個實(shí)際生產(chǎn)批次中5種中藥提取物的近紅外漫反射光譜，記錄了配液過程中的31個操作參數(shù)，作為自變量；記錄最終產(chǎn)品的總含固量和燈檢合格率，作為因變量。采用偏最小二乘回歸方法建立了定量校正模型，得到自變量和因變量之間的相關(guān)系數(shù)。所得總含固量和燈檢合格率定量校正模型的校正相關(guān)系數(shù)分別為0911 9，0873 8，交叉驗(yàn)證的相關(guān)系數(shù)分別為0724 2，0795 0。根據(jù)相關(guān)系數(shù)篩選出4個與總含固量相關(guān)性較強(qiáng)的因素，8個與燈檢合格率相關(guān)性較強(qiáng)的因素，并結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，對這些因素的實(shí)際意義進(jìn)行了分析。該文所建方法對配液過程中影響痰熱清注射液最終產(chǎn)品的因素進(jìn)行了初步辨識，結(jié)果合理，可推廣應(yīng)用于解決類似問題。

[關(guān)鍵詞]近紅外光譜； 痰熱清注射液； 配液過程； 影響因素分析； 過程分析技術(shù)

[Abstract]To recognize the key influential factors during the liquid preparation process of Tanreqing injection， the near infrared（NIR） spectra of the raw materials and the operating parameters of 24 batches of physical manufacturing were recorded as independent variables， and the total soluble solids contents and the light inspection acceptance rate of the final products were collected as dependent variables The calibration models were developed using the partial leastsquare regression （PLSR） method， and the correlation coefficients between the independent variables and the dependent variables were calculated For the quantitative models， the correlation coefficients for the calibration and inner cross validation of total soluble solids contents and the light inspection acceptance rate reached 0911 9， 0724 2 and 0873 8， 0795 9， respectively Using the correlation coefficients diagrams， several key influence factors were preliminarily determined， and the physical significance were analyzed combined with production experience This work demonstrated that NIR spectroscopy with PLSR algorithm could be used for the key influential factors recognization during the liquid preparation process of Tanreqing injection and can be popularized to solve similar problems

[Key words]near infrared spectroscopy； Tanreqing injection； liquid preparation process； key influential factors recognization； process analytical technology

痰熱清注射液是由熊膽粉、山羊角、黃芩、連翹、金銀花5種藥材制得，主治風(fēng)溫肺熱病屬痰熱阻肺癥，主要用于治療急性支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作以及上呼吸道感染[13]，2009年衛(wèi)生部公布的《甲型H1N1流感診療方案（2009試行版第三版）》中，痰熱清注射液被列為重癥與危重癥辯證治療方案治療藥物，療效顯著。痰熱清注射液的生產(chǎn)過程中，先將以上5種藥材分別進(jìn)行提取或水解、分離、純化，制成純度較高的提取物，然后采用提取物進(jìn)行配液，制得注射液成品。配液過程環(huán)節(jié)較多，操作復(fù)雜，是影響痰熱清注射液質(zhì)量的關(guān)鍵過程，筆者實(shí)驗(yàn)室以近紅外（near infrared， NIR）光譜為主要的技術(shù)工具，對這一過程所用的提取物質(zhì)量及過程監(jiān)控方法進(jìn)行了系統(tǒng)研究[49]，發(fā)現(xiàn)提取物質(zhì)量和配液過程直接影響成品質(zhì)量，需要進(jìn)行更為深入的研究。

痰熱清注射液成品的總含固量和燈檢合格率是2個重要的質(zhì)量指標(biāo)，關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量一致性和經(jīng)濟(jì)效益，但配液過程中影響這2個指標(biāo)的關(guān)鍵影響因素卻不夠清晰，有待進(jìn)行明確辨識，以便實(shí)施精確控制。Henriksen H C等[10]通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法分別研究了原料與過程變量對紙漿和奶酪產(chǎn)品質(zhì)量的影響，采用近紅外光譜的主成分得分值反映原料信息，結(jié)合蒸煮配方、蒸煮時間和切片質(zhì)量等工藝參數(shù)，預(yù)測了紙漿的卡伯值；Jrgensen K等[11]則采用傅里葉變化中紅外（FTIR）光譜的主成分得分值反映原料信息，結(jié)合蛋白質(zhì)含量、凝乳時間、發(fā)酵劑添加，凝固物切割等工藝參數(shù)，對干酪粉（一種表征產(chǎn)量損失的參數(shù)）進(jìn)行預(yù)測。類似方法對于中藥產(chǎn)品質(zhì)量參數(shù)的預(yù)測及其影響因素辨識具有一定的借鑒意義。但由于痰熱清注射液配液過程操作步驟多、時間長、成本高，很難通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)室模擬的方法獲取數(shù)據(jù)，而實(shí)際的批生產(chǎn)記錄中則記錄了較多的工藝參數(shù)數(shù)據(jù)，具有信息挖掘的加之。本文采集了24個批次的配液過程數(shù)據(jù)，包括5種提取物的NIR漫反射光譜和配液過程中的多項(xiàng)工藝參數(shù)，將各種提取物光譜的關(guān)鍵主成分得分值與各項(xiàng)工藝參數(shù)進(jìn)行歸一化處理后，建立回歸模型，對痰熱清注射液成品的總含固量和燈檢合格率進(jìn)行預(yù)測，初步辨識出了影響這2個質(zhì)量參數(shù)的主要因素。

1材料

Antaris Ⅱ型傅立葉變換型近紅外光譜儀（Antaris Ⅱ FTNIR，Thermo fisher公司，USA），配有積分球漫反射光譜采集配件和TQ analyst （V80， Thermo fisher公司，USA）數(shù)據(jù)分析軟件。PHSJ3F型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；全自動異物燈檢機(jī)（衛(wèi)材株式會社，日本）； ME104型電子天平（MettlerToledo公司，瑞士）。

痰熱清注射液24個實(shí)際生產(chǎn)批次所用的熊膽粉、山羊角、黃芩、連翹、金銀花提取物取樣，每個批次采集10 g樣品，用于光譜采集。

2方法

21樣品光譜采集采集24個批次所用到的5種提取物的樣品，利用Antaris Ⅱ型傅立葉變換型近紅外光譜儀采集樣品的NIR漫反射光譜。儀器采用積分球漫反射配件采集光譜，以儀器內(nèi)置背景為參比，樣品光譜采集溫度控制在25 ℃，波數(shù)4 000～1萬 cm-1 ，掃描次數(shù)64次，分辨率4 cm-1。5種提取物樣品的代表性NIR漫反射光譜見圖1。

22相關(guān)生產(chǎn)工藝參數(shù)采集各批次所用各種提取物的質(zhì)量、各種提取物單獨(dú)配液及總混時的脫色時間和溫度、靜置時間和保溫溫度、NaOH用量及配液后的pH、丙二醇及活性炭用量、三級濾芯老化程度、超濾時藥液壓力及溫度等，共31種。由于痰熱清注射液屬于中藥保護(hù)品種，部分工藝涉及保密，此處對其具體生產(chǎn)過程不作詳細(xì)描述。

23痰熱清注射液成品的質(zhì)量分析24個批次的痰熱清注射液成品的總含固量采用干燥失重法測得[12]，成品采用全自動異物燈檢機(jī)進(jìn)行檢查，燈檢合格率數(shù)據(jù)由上海凱寶藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部根據(jù)實(shí)際的燈檢結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析而得。

24數(shù)據(jù)處理方法包括NIR漫反射光譜數(shù)據(jù)的主成分分析（principal component analysis， PCA）、工藝參數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化和偏最小二乘回歸（partial least squares regression， PLSR）方法。分別采用TQ analyst （V80， Thermo fisher公司，USA）、Minitab （V14， Minitab公司，美國）和The Unscrambler （V75， CAMO公司，挪威）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

3結(jié)果與討論

31中藥提取物原料光譜的主成分分析中藥提取物物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，采用單一或某些化學(xué)成分的含量難以充分反映提取物的綜合信息，而NIR光譜信息豐富，不僅能夠反映樣品的組成信息，而且能夠反映樣品的物理狀態(tài)，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥提取物的質(zhì)量控制上[1315]。但NIR光譜變量之間信號重疊現(xiàn)象較為嚴(yán)重，數(shù)據(jù)的相關(guān)性較強(qiáng)，不利于進(jìn)行直接分析，需要進(jìn)行一定的數(shù)據(jù)處理。本文利用TQ Analyst數(shù)據(jù)處理軟件對黃芩、熊膽粉、山羊角、金銀花、連翹5種中藥提取物NIR漫反射光譜進(jìn)行主成分分析。進(jìn)行主成分分析之前，根據(jù)前期研究經(jīng)驗(yàn)，選用多元散射校正（multiplicative scatter correction， MSC），SavitzkyGolay平滑和一階導(dǎo)數(shù)對樣品光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，SavitzkyGolay平滑選用7點(diǎn)3階數(shù)據(jù)平滑。目的在于消除散射效應(yīng)，以及樣品背景顏色和其他因素常導(dǎo)致的光譜位移或漂移[5]。進(jìn)行主成分分析后，分別提取各種提取物光譜的前5個主成分得分值作為自變量。對于這5種中藥提取物而言，前5個主成分都反映了95%以上的光譜變化信息，可代替原始光譜對提取物原料進(jìn)行表征。

32數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化本項(xiàng)研究采集了痰熱清注射液配液過程中所用到的31種工藝操作參數(shù)，這些參數(shù)無論是數(shù)值，還是單位都有很大的不同，為了保證這些過程變量具有可比性，在建模之前需對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理的目的是消除不同量綱的參數(shù)對建模過程產(chǎn)生的影響，標(biāo)準(zhǔn)化處理采用Minitab數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行，方法是對各變量扣除平均值后除以該變量對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差，經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)用于建立模型。

33回歸模型的建立與驗(yàn)證利用The Unscrambler數(shù)據(jù)處理軟件建立PLSR模型，以5種中藥提取物NIR漫反射光譜的主成分得分值和過程工藝參數(shù)變量作為輸入變量，以產(chǎn)品的總含固量和燈檢合格率作為輸出變量，建立定量回歸模型。由于本文僅采用了24個批次的生產(chǎn)過程數(shù)據(jù)，樣本量相對較少，因此以留一法交叉驗(yàn)證（leaveoneout cross validation， LOOCV）結(jié)果對模型進(jìn)行評價，該方法每次將1個樣本作為測試樣本，而其他樣本作為訓(xùn)練集樣本，多次循環(huán)，直至每個樣品都被預(yù)測1次，統(tǒng)計(jì)預(yù)測結(jié)果，得到相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)值，該方法比較適用于樣本量較小時對模型性能進(jìn)行評價[1618]。以總含固量和燈檢合格率回歸模型為例，將中藥提取物NIR漫反射光譜的主成分得分值和過程工藝參數(shù)變量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后，采用偏最小二乘方法進(jìn)行降維，之后分別采用前9個和4個潛變量（latent variables， LVs）建立模型，模型的校正相關(guān)系數(shù)（Rc）分別為0911 9，0873 8，交叉驗(yàn)證的相關(guān)系數(shù)（Rcv）分別為0724 2，0795 0；校正集預(yù)測偏差（root mean square of calibration， RMSEC）分別為151%，014%，交叉驗(yàn)證預(yù)測偏差（root mean square error of cross validation， RMSECV）分別為162%，019%。痰熱清注射液總含固量和燈檢合格率2種質(zhì)量指標(biāo)真實(shí)值與模型預(yù)測值的相關(guān)圖見圖2。

不同于基于試驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)室模擬試驗(yàn)，本文所用數(shù)據(jù)來自實(shí)際生產(chǎn)，因此無論是提取物質(zhì)量（某些不同配液批次所用到的提取物為同一批次），還是實(shí)際操作參數(shù)，變化均較??；而且由于痰熱清注射液配液過程受提取物原料和諸多過程變量和偶然因素的影響，有些工藝參數(shù)無法進(jìn)行準(zhǔn)確、實(shí)時地記錄。同時，實(shí)際生產(chǎn)批次的產(chǎn)品質(zhì)量波動較小，不利于得到理想的建模效果，因此模型預(yù)測的精度不能達(dá)到很高，但可清晰地觀察到產(chǎn)品質(zhì)量與所考察的因素之間存在明顯的相關(guān)性。

34痰熱清注射液各質(zhì)量參數(shù)的影響因素分析分別計(jì)算各種變量與總含固量和燈檢合格率之間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient），繪制輸入變量與輸出變量的相關(guān)系數(shù)圖，見圖3，可以發(fā)現(xiàn)，總含固量受第10，27，34，46變量影響較大，這4個變量分別對應(yīng)著熊膽粉提取物NIR漫反射光譜的第5個主成分、黃芩提取物配液過程中NaOH的用量、山羊角單配液的二次脫色溫度和總混液的脫色溫度。說明總含固量受熊膽粉提取物質(zhì)量的影響，具體影響方式尚不清晰；黃芩配液過程中NaOH的用量是影響固含量一個重要因素，推測原因，可能是由于黃芩提取物中的主要成分為黃芩苷，而黃芩苷在堿性條件下溶解性能較好，如果pH達(dá)不到所需的范圍，則會出現(xiàn)溶解不充分的現(xiàn)象，導(dǎo)致存在難溶性顆粒，因此NaOH的用量會影響到最終產(chǎn)品的總含固量；山羊角提取物單配液的脫色是利用活性炭吸附后過濾，以除去山羊角提取物中的難溶性雜質(zhì)，由于山羊角提取物來自動物藥材，大分子雜質(zhì)相對其他幾種提取物較多，因此只有山羊角提取物的單配過程需要進(jìn)行2次脫色，而活性炭的吸附性能受溫度影響較大，因此，最終的固含量也會受山羊角單配液的2次脫色溫度的影響；同理，總混液的脫色溫度也是影響產(chǎn)品總含固量的一個重要因素。

燈檢合格率主要取決于成品中可見異物的含量，可見異物是導(dǎo)致中藥注射劑不良反應(yīng)的重要因素之一，燈檢不合格的產(chǎn)品必須報廢。由于原料因素，痰熱清注射液生產(chǎn)成本較高，燈檢合格率是影響產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)效益的一個重要因素，也是關(guān)乎產(chǎn)品安全性的一個重要指標(biāo)，因此是廠方最為關(guān)注的問題[19]。研究發(fā)現(xiàn)，該項(xiàng)指標(biāo)受第9，21，32，37，40，42，50，56輸入變量的影響較大，這8個輸入變量分別對應(yīng)著熊膽粉提取物NIR漫反射光譜的第4個主成分、連翹提取物NIR漫反射光譜的第1個主成分、山羊角配液過程中NaOH的用量、連翹提取物的用量、金銀花與連翹提取物混合溶液的pH、熊膽粉

提取物的用量、總混液超濾溫度和最終產(chǎn)品的pH。表明痰熱清注射液中可見異物主要來自熊膽粉提取物和連翹提取物，與金銀花和山羊角提取物也存在一定的關(guān)系，但與黃芩提取物無顯著相關(guān)，這是因?yàn)辄S芩提取物中黃芩苷含量大都在95%以上純度較高，而其他幾種提取物純度相對較低，成分較為復(fù)雜，難以進(jìn)行較為嚴(yán)格的控制；可見異物受多個pH調(diào)節(jié)操作步驟的影響，pH不同，中藥提取物中各種物質(zhì)的溶解效果也不同；超濾時藥液的溫度也是一個重要影響因素，這是因?yàn)槌瑸V膜的過濾性能受溫度影響顯著，同時溫度不同，各種物質(zhì)的溶解性能也不同。

以痰熱清注射液灌封前的pH這一工藝參數(shù)為例，在24批生產(chǎn)記錄中，其波動情況見圖4，pH在826±013。由于pH是影響各種化學(xué)成分溶解度的主要因素，因此也是導(dǎo)致可見異物含量出現(xiàn)波動的重要因素，因此，如果能在工藝許可的條件下，對最終pH進(jìn)行一次調(diào)節(jié)，進(jìn)一步縮小最終產(chǎn)品pH的波動范圍，則對于提高產(chǎn)品的批次一致性和減少可見異物，都將具有一定的意義。

綜上所述，為了確保痰熱清注射液產(chǎn)品中總含固量穩(wěn)定和盡可能減少可見異物，提高痰熱清注射液的燈檢合格率，需要針對涉及到的中藥提取物進(jìn)

行更為嚴(yán)格的質(zhì)量控制；同時采取一定措施，重點(diǎn)控制影響較大的工藝參數(shù)，確保其穩(wěn)定。這也是本研究的工業(yè)意義所在。當(dāng)然，限于本文所采用的樣品量，以上影響因素對最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響方式及其定量關(guān)系，仍有待進(jìn)一步研究。

4結(jié)論

本文研究利用5種中藥提取物原料的NIR漫反射光譜數(shù)據(jù)結(jié)合痰熱清注射液配液過程的31個工藝參數(shù)建立了痰熱清注射液成品品質(zhì)參數(shù)的預(yù)測模型，通過因果分析排查了關(guān)鍵的工藝參數(shù)，初步辨識了痰熱清注射液總含固量和燈檢合格率2個主要質(zhì)量參數(shù)的關(guān)鍵影響因素。所得結(jié)果提示配液過程的操作者在操作過程中，必須針對這些關(guān)鍵因素進(jìn)行更為嚴(yán)格的控制，以確保最終產(chǎn)品的各項(xiàng)品質(zhì)參數(shù)達(dá)標(biāo)、穩(wěn)定，提高產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量一致性。該方法需要對生產(chǎn)現(xiàn)場的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確記錄，為使模型更為穩(wěn)健，預(yù)測效果更為理想，因果關(guān)系更為明確，需要進(jìn)行長期的數(shù)據(jù)積累，并探索更為高效的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)。但本研究結(jié)果表明，可以利用該方法對影響產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵工藝參數(shù)進(jìn)行初步辨識，從而更具針對性地對痰熱清注射液配液過程實(shí)施精準(zhǔn)控制。鑒于其他中藥制劑，尤其是中藥注射劑的生產(chǎn)也存在類似的共性問題，因此，本文所提出的方法也可為其他中藥注射液品種的相關(guān)研究提供參考。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]