高秀妹 曹紅收 劉占艷/山東省無(wú)棣縣畜牧獸醫(yī)局

如何提高ELISA測(cè)定的準(zhǔn)確性

高秀妹 曹紅收 劉占艷/山東省無(wú)棣縣畜牧獸醫(yī)局

近幾年，畜產(chǎn)品質(zhì)量安全意識(shí)與日俱增，動(dòng)物疫病形勢(shì)復(fù)雜化，基層動(dòng)物疫病防控部門做好動(dòng)物疫病篩查工作顯得尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）因其具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于血清、尿、飼料等樣品篩檢中。ELISA試驗(yàn)看似簡(jiǎn)單但在實(shí)際的操作中，影響測(cè)定結(jié)果的因素較多，稍有不慎便會(huì)導(dǎo)致弱板、白板、花板等不正常現(xiàn)象或假陽(yáng)性、假陰性等異常結(jié)果。筆者對(duì)ELISA測(cè)定過(guò)程中出現(xiàn)一些問(wèn)題進(jìn)行了分析和總結(jié)，要想做好ELISA試驗(yàn)需三個(gè)方面著手。

一、試劑

檢測(cè)試劑應(yīng)選擇正規(guī)廠家、靈敏度高、特異性好、操作方便省時(shí)的試劑，切忌混用同廠家生產(chǎn)的不同批號(hào)的試劑。另外，試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫（25℃）,這樣可以避免試驗(yàn)反應(yīng)不充分、弱陽(yáng)性樣品檢測(cè)假陰性結(jié)果等現(xiàn)象的發(fā)生。此外，稀釋試劑的水必須使用重蒸水或去離子水，其他水因雜質(zhì)過(guò)多或有酸堿度都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

二、樣品

1.樣品處理。ELISA測(cè)定結(jié)果的判定是通過(guò)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）與特異性結(jié)合產(chǎn)生的抗原-抗體復(fù)合物相互作用后顯色與否來(lái)實(shí)現(xiàn)的。對(duì)樣品篩選或處理要嚴(yán)格，否則會(huì)直接導(dǎo)致結(jié)果呈假陽(yáng)性或假陰性等異?，F(xiàn)象。如溶血和被細(xì)菌污染的樣品、冰箱中保存過(guò)久的樣品等導(dǎo)致假陽(yáng)性出現(xiàn)；反復(fù)凍融會(huì)使樣品效價(jià)降低，導(dǎo)致假陰性出現(xiàn)。一般來(lái)說(shuō)，一周內(nèi)測(cè)定的4℃～8℃冷藏保存，一周后測(cè)定的-20℃冷凍保存，長(zhǎng)期保存多次測(cè)定的樣品要分裝冰凍保存。

2.樣品稀釋。凡是ELISA檢測(cè)試劑盒，均要求將樣品稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，并且不同試劑盒對(duì)樣品稀釋倍數(shù)均有嚴(yán)格規(guī)定，以降低非特異反應(yīng)的概率，同時(shí)保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。若操作者未能理解其意義，沒(méi)有嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作，導(dǎo)致移取計(jì)量不精準(zhǔn)，造成樣品稀釋倍數(shù)相差甚遠(yuǎn)，那么檢測(cè)結(jié)果肯定會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重偏差。

三、操作

1.加樣。首先加樣不可太快，否則無(wú)法保證加樣劑量的準(zhǔn)確性和均一性。其次要避免將液體加在反應(yīng)孔壁上部，可能會(huì)導(dǎo)致非特異性吸附。此外，要做到一份樣品一個(gè)移液搶頭，以防交叉污染。

2.溫育。溫育是ELISA測(cè)定中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，只有在一定適宜的溫度和與之相對(duì)應(yīng)的特定時(shí)間，液相中的抗原（抗體）才能與固相載體上的特異抗體（抗原）充分結(jié)合。不同試劑盒有不同的溫育溫度和時(shí)間的要求，應(yīng)嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作，不能人為改變。此外，微孔板溫育時(shí)要加貼封片，這樣可以防止孔內(nèi)液體蒸發(fā)或水珠等雜質(zhì)滴入孔內(nèi)影響檢測(cè)結(jié)果。

3.洗板。洗板是將溫育過(guò)程中液相非特異性成分與反應(yīng)中固相載體的抗原（抗體）結(jié)合產(chǎn)生的抗原抗體清除出去，從而保證ELISA測(cè)定的特異性。同樣，每個(gè)試劑盒對(duì)洗板的次數(shù)和侵泡時(shí)間都有明確規(guī)定，絕不能擅自更改。此外，洗滌液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，洗板時(shí)不要讓洗液溢出，每次甩板拍干后的吸水紙一定要更換，尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙，否則影響試驗(yàn)結(jié)果。

4.顯色。一般來(lái)說(shuō)，顯色時(shí)間過(guò)短，結(jié)果偏低，顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)照值偏高或非特異性顯色概率增加，因此，顯色一定要嚴(yán)格按照說(shuō)明書要求控制好時(shí)間。此外，不同試劑盒對(duì)酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)有明確要求，上機(jī)時(shí)需稍加注意。

此外，在反應(yīng)板上的整個(gè)操作過(guò)程，操作手法應(yīng)一致，加樣時(shí)避免產(chǎn)生氣泡，以免反應(yīng)不完全或比色結(jié)果不準(zhǔn)確。

總之，只要操作者按照說(shuō)明書要求操作，專心細(xì)致，精益求精，就一定能大大降低異常結(jié)果出現(xiàn)的概率，體現(xiàn)ELISA試驗(yàn)的優(yōu)越性。