鐘鳴，劉英霞，翁劍華，趙文麗

(惠州市第一人民醫(yī)院，廣東惠州516003)

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Pin1、CyclinD1蛋白表達變化及意義

鐘鳴，劉英霞，翁劍華，趙文麗

(惠州市第一人民醫(yī)院，廣東惠州516003)

目的 觀察Pin1和CyclinD1蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達并探討其臨床意義。方法 采用免疫組化法檢測108例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌和30例正常乳腺組織石蠟切片中Pin1和CyclinD1蛋白表達，分析二者表達與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 Pinl蛋白在正常乳腺組織中不表達，在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，微弱表達時胞核少許輕微著色，過表達時胞核和胞質(zhì)均著色。Pinl蛋白在55.6%(60/108)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者癌組織中呈陽性或強陽性表達。Pin1蛋白表達與患者組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05),而與年齡、腫瘤大小、臨床分期無關(guān)(P均>0.05)。CyclinD1蛋白在正常乳腺組織中不表達。CyclinD1蛋白在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，65例表達陽性，陽性表達率為60.2%。CyclinD1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),而與年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、臨床分期無關(guān)(P均>0.05)。在浸潤性導(dǎo)管癌組織中Pin1與CyclinD1蛋白表達呈正相關(guān)(r=0.224,P<0.05)。結(jié)論 Pin1和CyclinD1蛋白在浸潤性乳腺癌組織中呈高表達；二者可能在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；Pin1蛋白；CyclinD1蛋白；免疫組織化學(xué)

肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶Pin1是一種高度保守的、特異性多肽脯氨?；樂串悩?gòu)酶，能特異性地識別和結(jié)合磷酸化蛋白質(zhì)的絲/蘇氨酸-脯氨酸基序，并催化其發(fā)生順反異構(gòu)，然后調(diào)控諸多細胞周期蛋白的構(gòu)象，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖與分化。最近國外大量研究發(fā)現(xiàn)，Pin1過表達與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其可直接或間接與CyclinD1相互作用而調(diào)節(jié)細胞周期。雖然在各種腫瘤發(fā)病機制中的作用尚存在爭議，但進一步研究Pin1作用將為各種腫瘤的病因、預(yù)防和治療提供新的思路和方法。2016年12月，我們采用免疫組化法對乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Pin1及CyclinD1蛋白表達進行檢測，同時分析二者表達與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者臨床病理特征的關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集我院2011年4月～2013年3月的108例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者手術(shù)切除標(biāo)本或粗針穿刺活檢標(biāo)本制成的蠟塊，患者年齡28～66歲。送病理前均未進行任何治療。乳腺癌病理學(xué)分型及組織學(xué)分級參照2010年乳腺癌WHO 分類和分級標(biāo)準(zhǔn)。腫瘤直徑≥3 cm者70例；組織學(xué)分級Ⅰ+Ⅱ級52例，Ⅲ級56例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期70例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移57例。選取同期30例份正常乳腺組織作對照，年齡38～64歲。

1.2 Pin1及CyclinD1蛋白表達檢測 采用免疫組化Envision法。一抗分別為濃縮型兔抗人Pinl多克隆抗體(美國Santa Cruz公司，SC-15340，工作濃度1∶300)；濃縮型兔抗人CyclinD1單克隆抗體(ZA-0101，工作濃度1∶50)；二抗和顯色檢測系統(tǒng)均為DAKO Envision檢測試劑套盒。試劑均購自上?；蚩萍加邢薰?。用已知的Pin1、CyclinD1陽性切片作為陽性對照，用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定8～12 h，常規(guī)石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)二甲苯脫蠟和梯度乙醇至水后，pH值9.0 Tris-EDTA微波修復(fù)20 min，3%過氧化氫水溶液阻斷10 min，浸洗PBS 5 min×3次，一抗室溫孵育1 h，浸洗PBS 5 min×3次，二抗室溫孵育30 min，浸洗PBS 5 min×3次，在顯微鏡下控制DAB顯色3～5 min，蘇木素復(fù)染2 min，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，飽和碳酸鋰水溶液返藍數(shù)秒，梯度乙醇脫水透明，中性樹膠封片。在盲法下，每張切片選擇5個高倍視野，每高倍視野計數(shù)100個瘤細胞，由2名病理醫(yī)師獨立計數(shù)，取平均值進行分析。Pin1陽性染色位于胞核，過表達時胞核胞質(zhì)均著色。CyclinD1蛋白定位于胞核。Pin1和CyclinD1免疫組化檢測結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：A染色強度分級：無染色者計0分，可見淡黃色顆粒計1分，較多棕黃色顆粒計2分，大量棕黃色顆粒計3分；B陽性細胞數(shù)分級：陽性細胞率<1%計0分，陽性細胞率1%～33%計1分，陽性細胞率34%～66%計2分，陽性細胞率≥67%計3分；隨后根據(jù)兩項的積分對結(jié)果進行判定：積分數(shù)=A×B。當(dāng)A×B<3分時判為低水平表達，計為陰性(-)；當(dāng)A×B≥3分時判為高水平或過表達，計為陽性(+)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，Pin1和CyclinD1蛋白的相關(guān)性分析采用Spearman法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中Pin1、CyclinD1蛋白表達及其與患者臨床病理特征的關(guān)系 Pin1蛋白在正常乳腺組織中不表達，在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，微弱表達時胞核少許輕微著色，過表達時胞核和胞質(zhì)均著色。Pin1蛋白在55.6%(60/108)乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者癌組織中呈陽性或強陽性表達。Pin1蛋白表達與患者組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05),組織學(xué)分級級Ⅰ+Ⅱ級陽性表達率為55.8%，Ⅲ級為55.4%；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率為68.4%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率41.2%。Pin1蛋白表達與年齡、腫瘤大小、臨床分期無關(guān)(P均>0.05)。CyclinD1蛋白在正常乳腺組織中不表達。CyclinD1蛋白在乳腺癌組織中陽性表達定位于細胞核，65例表達陽性，陽性表達率為60.2%。CyclinD1蛋白表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率為74.1%，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽性表達率44.0%。CyclinD1蛋白表達與年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級、臨床分期無關(guān)(P均>0.05)。

2.2 Pin1和Cyclin D1蛋白表達的相關(guān)性分析 在Pin1表達陽性的60例乳腺癌中有42例CyclinD1表達表達陽性，在Pin1表達陰性的48例乳腺癌中有25例CyclinD1表達陰性，二者在乳腺癌中的表達呈正相關(guān)(r=0.224,P<0.05)。

3 討論

肽基脯氨酰異構(gòu)酶Pin1使磷酸化絲/蘇氨酸-脯氨酰鍵發(fā)生異構(gòu)化，這種異構(gòu)化在調(diào)節(jié)細胞動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Pin1通過其氨基末端的WW結(jié)構(gòu)域與磷酸化絲/蘇氨酸-脯氨酸結(jié)合及其羧基末端PPIase域催化中間的肽鍵發(fā)生順反異構(gòu)化，最終導(dǎo)致其底物的構(gòu)象發(fā)生變化[2]。Pin1誘導(dǎo)構(gòu)象變化磷酸化后調(diào)控諸多蛋白質(zhì)的功能，包括催化活性水平，磷酸化狀態(tài)，蛋白質(zhì)相互作用，亞細胞定位，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[3]。Tao等[4]報道，Pin1本身不是致癌基因，但其可能是致癌信號傳導(dǎo)過程中一個不可缺少的翻譯器和放大器。Pin1特異性識別磷酸化絲/蘇氨酸-脯氨酸的基序和調(diào)節(jié)磷酸化位點的構(gòu)象，這可能激活腫瘤發(fā)生過程中多條致癌信號通路。因此，Pin1的功能多態(tài)性在生物學(xué)上可能是癌癥的重要病因?qū)W[5]。本研究結(jié)果提示，Pin1在正常乳腺組織中不表達或呈微弱表達，而在乳腺癌組織中呈高表達。Pin1低表達時主要定位于細胞核，高表達時胞漿胞核均會著色，此與文獻報道相似[6]。因Pin1本身不含有胞核定位信號，主要通過WW區(qū)域和底物相互作用定位于細胞內(nèi)，因細胞狀態(tài)不同而異。同時，Pin1過表達與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),而與年齡、腫瘤大小、臨床分期無明顯相關(guān)性。這可能是因Pin1靶底物近30種，參與調(diào)解細胞多個進程。據(jù)文獻報道，Pin1放大諸多致癌信號傳導(dǎo)途徑，抑制多種腫瘤抑制基因，促進乳腺癌細胞的血管生成和轉(zhuǎn)移[7]。本研究結(jié)果提示Pin1過表達可能促進乳腺癌生長，但由于樣本量有限，結(jié)論可能存在一定偏差，有待進一步擴大樣本予以證實。

Pin1是由酵母雙雜交篩選出的一種功能蛋白，主要調(diào)節(jié)有絲分裂相關(guān)蛋白酶，對細胞周期發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。周期素中的CyclinD1是細胞周期成分中與腫瘤有直接關(guān)系的癌基因[8]。Pin1的靶蛋白有20多種，其中研究最多的就是CyclinD1，CyclinD1作為G1期細胞周期相關(guān)蛋白其基因和編碼蛋白的異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。研究表明，CyclinD1是Pin1作用的重要靶蛋白之一，Pin1不僅可從轉(zhuǎn)錄水平促進CyclinD1轉(zhuǎn)錄，而且還能通過誘導(dǎo)CyclinD1從胞核移至胞漿降解，進而引起CyclinD1過表達，促進乳腺上皮細胞轉(zhuǎn)化增殖。本研究結(jié)果顯示，Pin1在正常乳腺組織中不表達，僅在乳腺癌組織中著色。在Pin1過表達的60例乳腺癌中42例合并有CyclinD1高表達，而在Pin1低表達的48例乳腺癌中僅有25例CyclinD1陰性表達，與此同時CyclinD1表達還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。Wang等[9]報道在腫瘤發(fā)生癌變過程中，Ras信號和CyclinD1過表達起關(guān)鍵作用，Pin1過表達后上調(diào)CyclinD1蛋白表達并激活其啟動子。此外，Pin1通過激活JNK或致癌的Ras與c-Jun結(jié)合，使絲氨酸63/73-脯氨酸磷酸化?？傊?，Pin1無論是激活Ras還是JNK，均是為提高CyclinD1啟動子c-Jun的轉(zhuǎn)錄活性。Pin1在前列腺癌[10]、鼻咽癌[11]、宮頸癌[12]等亦上調(diào)CyclinD1表達。Pin1可能直接或間接與CyclinD1相互作用而調(diào)節(jié)細胞周期，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。基于Pin1在正常乳腺組織和在乳腺癌組織中的表達水平差異，故有可能通過檢測 Pin1過表達來實現(xiàn)腫瘤的早期診斷。Pin1在多種腫瘤中高表達說明其可用作腫瘤標(biāo)記的參考指標(biāo)，其表達與腫瘤的臨床病理因素、腫瘤預(yù)后等的關(guān)系有待后續(xù)深入研究。

綜上所述，Pin1和CyclinD1蛋白在浸潤性乳腺癌組織中呈高表達；二者可能在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮協(xié)同作用。

[1] Miyashita H, Mori S, Motegi K， et al. Pinl is overexpressed inoral squamous cell carcinoma and its levels correlate with cyclin D1 overexpression[J]． Ocol Rep， 2003，10(2)：455-461．

[2] Bae JS, Noh SJ, Kim KM, et al. PIN1 in hepatocellular carcinoma is associated with TP53 gene status[J]. Oncology Reports, 2016,36(4):2405-2411.

[3] Kim G, Khanal P, Kim JY, et al. COT phosphorylates prolyl-isomerase Pin1 to promote tumorigenesis in breast cancer[J]. Molecular Carcinogenesis, 2015,54(6):440-448.

[4] Tao LJ, Chen YS, Yao L, et al. PIN1 promoter polymorphism (-842 G>C) contributes to a decreased risk of cancer: Evidence from meta-analysis[J]. Oncol Lett, 2014,8(3):1360-1366.

[5] Xu M, Cheung CC, Chow C, et al. Overexpression of PIN1 enhances cancer growth and aggressiveness with cyclin D1 induction in EBV-associated nasopharyngeal carcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(6)：e0156833.

[6] You Y, Deng J, Zheng J, et al. Functional polymorphisms in PIN1 promoter and esophageal carcinoma susceptibility in Chinese population[J]. Mol Biol Rep, 2013,40:829-838.

[7] Beretta GL, De Cesare M, Albano L, et al. Targeting peptidyl-prolyl isomerase pin1 to inhibit tumor cell aggressiveness[J]. Tumori, 2016,102(2):144-149.

[8] 張萍，高媛.CyclinD1在腫瘤中的表達及意義[J].山東醫(yī)藥，2005,45(34):69-70.

[9] Wang JZ, Liu BG. Pin1-based diagnostic and therapeutic strategies for breast cancer[J]. Pharmacol Res, 2015,9(3):28-35.

[10] Kanaoka R, Kushiyama A, Seno Y, et al. Pin1 inhibitor juglone exerts anti-oncogenic effects on LNCaP and DU145 cells despite the patterns of gene regulation by Pin1 differing between these cell lines[J]. PLoS One, 2015,10(6)：e0127467.

[11] Xu M, Cheung CC, Chow C, et al. Overexpression of PIN1 Enhances Cancer Growth and Aggressiveness with Cyclin D1 Induction in EBV-Associated Nasopharyngeal Carcinoma[J]. PLoS One, 2016,11(6):e0156833.

[12] Wang T, Liu Z, Shi F, et al. Pin1 modulates chemo-resistance by up-regulating FoxM1 and the involvements of Wnt/beta-catenin signaling pathway in cervical cancer[J]. Mol Cell Biochem, 2016,413(1-2):179-187.

惠州市科技局研究項目(0039107150321045)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.09.018

R737.9

B

1002-266X(2017)09-0055-03

2016-11-15)