陳文峰 石運(yùn)芝

(泰山醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院,山東泰安 271000)

乳牙牙髓干細(xì)胞最新研究進(jìn)展*

陳文峰 石運(yùn)芝

(泰山醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院,山東泰安 271000)

乳牙牙髓干細(xì)胞;多向分化;組織再生

乳牙牙髓干細(xì)胞(stem cell from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是由施松濤教授于2003年首次在脫落的乳牙中發(fā)現(xiàn)，后經(jīng)Miura等人[1]證實(shí)， SHED具有較強(qiáng)增殖和多向分化潛能。迄今為止在口腔中已分離出五種牙源性干細(xì)胞：脫落乳牙牙髓干細(xì)胞(SHED)，恒牙牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cell，DPSC)，牙囊干細(xì)胞(dental follicle stem cell，DFSC)，牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cell，PDLSC)。而SHED易于操作，不存在免疫和排斥反應(yīng)，在組織工程學(xué)中作為種子細(xì)胞越來越受關(guān)注。本文就乳牙牙髓干細(xì)胞的最新研究進(jìn)展、臨床前應(yīng)用、未來前景等做一綜述。

1 乳牙牙髓干細(xì)胞的生物學(xué)特性

SHED起源于神經(jīng)嵴，存在于牙髓血管周圍，可被誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞、皮膚細(xì)胞和成牙本質(zhì)細(xì)胞。在適宜的條件下，SHED表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物如CD105、CD90、CD146、CD44，也表達(dá)多種生長因子(FGF、TGF-β，CTGF，NGF，BMP)，還參與細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的形成，但不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記、淋巴細(xì)胞或白細(xì)胞抗原[1]。

在兒童及青少年脫落的乳牙中含有豐富的SHED，最近的研究表明：SHED具有多向分化潛能，可治療包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、缺血性腦損傷、脊髓損傷和肌萎縮等動物模型的疾病[2-4]，相比其他干細(xì)胞SHED無論在分離培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化上都較為可行，現(xiàn)將其優(yōu)點(diǎn)通過比較列舉如下：

1.1 乳牙牙髓干細(xì)胞相比胚胎干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)

就取材方面考慮，SHED來源廣且成本低，人類共有20顆乳牙，在生長發(fā)育過程中，可從自然脫落的乳牙中獲得，這比從骨髓中穿刺提取骨髓干細(xì)胞方便得多且成本和準(zhǔn)備時(shí)間大大降低。倫理道德方面，乳牙牙髓干細(xì)胞不存在倫理道德的爭議，這是相對胚胎干細(xì)胞的一大優(yōu)點(diǎn)。SHED安全風(fēng)險(xiǎn)低，干細(xì)胞治療必須克服腫瘤的發(fā)生和強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，而到目前為止，移植乳牙牙髓干細(xì)胞沒有畸胎瘤或癌癥等形成報(bào)告。此外就增殖和分化潛能方面，很多研究表明乳牙牙髓干細(xì)胞具有較高的增殖率，不論在表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物，還是基因編碼的細(xì)胞表面蛋白水平都高于胚胎干細(xì)胞。

1.2 乳牙牙髓干細(xì)較其他牙源性干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)

首先SHED較DPSC、PDLSC易得且創(chuàng)傷小。其次，SHED具有更好的增殖和分化特性。第三，低溫冷凍保存乳牙較恒牙更為可行。Lindemann等人[5]研究發(fā)現(xiàn)在脫落的乳牙中，由于牙根吸收牙髓腔暴露，低溫保護(hù)劑更易吸收。而對于保存完整的恒牙，由于根尖孔較乳牙狹窄冷凍保護(hù)劑不易滲入牙髓中，冷凍保存的效果不及乳牙。因此，脫落乳牙在牙齒干細(xì)胞保存中有較好的應(yīng)用前景。

2 SHED在臨床前疾病治療應(yīng)用進(jìn)展

隨著人類對SHED的深入研究，越來越多臨床前動物模型實(shí)驗(yàn)研究證明SHED在治療阿茲海默病、帕金森病、急性炎癥、糖尿病等動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图膊≈芯哂酗@著療效[6-9]。

2.1 SHED與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

SHED具有良好的神經(jīng)分化功能，在含有生長因子培養(yǎng)基中，SHED可失去成纖維細(xì)胞外觀而獲得神經(jīng)形態(tài)，并且隨時(shí)間延長βIII-tubulin、NeuN、NFM等神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)水平增加。Morsczeck等[10]在對SHED進(jìn)行神經(jīng)分化研究發(fā)現(xiàn)，相比DPSC和DFSC，SHED無論是在自發(fā)或有化學(xué)誘導(dǎo)劑(維甲酸、二甲基亞砜)存在情況下神經(jīng)分化時(shí)間總比DFSC快4倍左右，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在這3種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中有相似的生物學(xué)形態(tài)和干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)，但只有SHED表達(dá)視網(wǎng)膜干細(xì)胞標(biāo)志物(Pax6)，這可能提示SHED有更好的神經(jīng)細(xì)胞分化潛能。

在適當(dāng)?shù)臈l件下SHED可以分化為有功能的神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞，將這些細(xì)胞移植到動物模型中可緩解各種急慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。SHED分離培養(yǎng)主要集中在酶消化法上，王勁松[11]用此法培養(yǎng)SHED至第3代時(shí)，在加入神經(jīng)干細(xì)胞的特殊培養(yǎng)基中SHED可分化形成神經(jīng)球，并經(jīng)Real-Time PCR檢測，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后的細(xì)胞隨著時(shí)間延長膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子濃度明顯增高。在此基礎(chǔ)上，Hiromi等[7]用表皮生長因子和堿性成纖維細(xì)胞生長因子信號通路激活SHED表達(dá)原神經(jīng)基因，待分化成熟為黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元(dsheds)時(shí)，移植到帕金森病大鼠模型中，與接受PBS或移植成纖維細(xì)胞模型的大鼠對比發(fā)現(xiàn)，接受SHED的大鼠行為學(xué)有顯著改善。這一結(jié)論為應(yīng)用SHED進(jìn)行帕金森病研究提供了基礎(chǔ)。

與帕金森病相似的阿茲海默病(AD)都是漸進(jìn)性神經(jīng)退行性疾病，和帕金森病不同的是AD的特點(diǎn)是認(rèn)知能力下降和大腦中出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白斑塊。Tsuneyuki等[6]對SHED、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)和人皮膚成纖維細(xì)胞在AD小鼠模型認(rèn)知能力的改善中比較發(fā)現(xiàn)：接受SHED無血清培養(yǎng)液的小鼠表現(xiàn)出認(rèn)知能力顯著提高，而接受BMSC和成纖維細(xì)胞的對照組則改善不明顯。由此表明SHED能改善小鼠模型認(rèn)知功能障礙。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SHED、BMSC、纖維培養(yǎng)液都能抑制AD小鼠3-硝基酪氨酸和一氧化氮合成酶II的產(chǎn)生，但是SHED能將小鼠促炎性腦環(huán)境轉(zhuǎn)化為抗炎性腦環(huán)境，其中抗炎因子IL-10出現(xiàn)高表達(dá)。此外SHED增加了腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子和胰島素樣生長因子的表達(dá)，同時(shí)SHED抑制谷氨酸活性，對谷氨酸神經(jīng)毒性起到保護(hù)作用。

還有研究表明SHED在脊髓損傷修復(fù)中發(fā)揮著獨(dú)特效果。早在三十年前就有研究BMSC治療脊髓損傷動物模型，但培養(yǎng)BMSC需進(jìn)行骨髓穿刺，這就會引發(fā)感染和疼痛等危險(xiǎn)。SHED的移植治療在很大程度上可解決這一問題。Sakai等[12]在研究大鼠脊髓完全橫斷模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，接受SHED的大鼠運(yùn)功恢復(fù)情況明顯高于接受移植的BMSC和皮膚來源的成纖維細(xì)胞的大鼠，并提出了SHED用于神經(jīng)再生活性的三個(gè)主要機(jī)制：(1)抑制神經(jīng)元，星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而提高對神經(jīng)纖維和髓鞘的保護(hù)；(2)恢復(fù)切斷軸突的再生通過直接抑制多個(gè)軸突的生長抑制因子，包括硫酸軟骨素蛋白多糖和髓鞘相關(guān)糖蛋白；(3)取代丟失或損傷的細(xì)胞通過分化為成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞等。

2.2 SHED與免疫系統(tǒng)疾病

近年來研究發(fā)現(xiàn)SHED除有多向分化潛能外，還具有較好的免疫調(diào)控作用。在對SHED、DPSC、DFSC的免疫特性比較發(fā)現(xiàn)，三者都能夠抑制淋巴細(xì)胞增殖，增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-10水平，降低IL-4和 IFN-γ水平。在免疫調(diào)節(jié)能力上SHED略低于DFSC，但 SHED表達(dá)Fas的配體(CD178)可顯著抑制IFN-γ刺激，降低炎癥反應(yīng)[13]?；赟HED在動物模型的研究基礎(chǔ)上，目前已較多應(yīng)用于急性炎癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)等臨床前實(shí)驗(yàn)中。

在SHED、BMSC移植治療SLE小鼠模型中，對免疫功能及療效恢復(fù)情況發(fā)現(xiàn)，移植SHED的小鼠能降低自身抗核抗體水平，降低外周免疫球蛋白，如IgG1、IgG2a、IgM，改善腎功能，延長其壽命。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SHED相對于BMSC在上調(diào)T細(xì)胞，減少外周血Th17細(xì)胞水平中發(fā)揮著顯著的免疫調(diào)節(jié)作用[2]。

炎癥反應(yīng)伴隨者免疫應(yīng)答，大量的研究發(fā)現(xiàn)SHED在一定程度上可抑制炎癥反應(yīng)，加強(qiáng)免疫應(yīng)答。Ugne等人[8]在研究SHED和糖皮質(zhì)激素在抑制小鼠急性炎癥模型發(fā)現(xiàn)，SHED和糖皮質(zhì)激素都具有明顯的抗炎作用，但在體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)顯示兩者炎性蛋白酶失活動力學(xué)存在顯著差異，這一結(jié)果提示SHED和糖皮質(zhì)激素有不同的抗炎模式。糖皮質(zhì)激素抑制炎癥經(jīng)典機(jī)制是抑制磷脂酶A2(PLA2)和環(huán)氧化酶2(COX2)合成的前列腺素和白三烯等。PLA2通路抑制作用是通過增加膜聯(lián)蛋白A1的合成與功能實(shí)現(xiàn)的。而與此不同的是，SHED分泌因子中攜帶GTP激活磷脂酶和脂質(zhì)介質(zhì)，運(yùn)輸?shù)腜LA2和脂質(zhì)介質(zhì)到達(dá)炎癥部位可能是外來抗炎作用的另一機(jī)制。這一發(fā)現(xiàn)和Hirotaka等人[14]研究結(jié)果相似，他們將SHED無血清培養(yǎng)液注射到博萊霉素(BLM)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(ALI)的模型中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可減輕小鼠肺部的炎癥而提高小鼠生存率。但目前對SHED通過什么介質(zhì)影響PLA2、COX2和iNOS的信號分子通路存在這很大爭議，這提示著未來的研究方向?qū)嚓P(guān)注在SHED如何影響PLA2、COX2的表達(dá)和急性炎癥部位iNOS的信號通路。

2.3 SHED與成牙及成骨

過去的相關(guān)鑒定結(jié)果表明，SHED在體外可分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生成骨細(xì)胞。對此功能，有關(guān)學(xué)者又進(jìn)行了深入的研究。Bakopouioub等[15]研究發(fā)現(xiàn)隨SHED分離方式不同其形成的牙本質(zhì)也有差別。SHED通過酶降解法分離后能迅速產(chǎn)生礦化組織，但礦化組織仍保留SHED的梭形形態(tài)，而對SHED直接生長后的產(chǎn)物進(jìn)行分離培養(yǎng)，盡管礦化速率較低，但獲得了功能性成牙本質(zhì)細(xì)胞。這一結(jié)果表明直接培養(yǎng)法在SHED形成牙本質(zhì)中較為可行。與DPSC不同的是SHED只能形成牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)但不能形成牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體?；谶@些研究任飛等人[16]通過轉(zhuǎn)化生長因子β3(TGF-β3)聯(lián)合肝素對SHED進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶9(AKP)活性明顯增強(qiáng)，14天時(shí)在鏡下觀察到黃褐色結(jié)晶，28d時(shí)茜素紅染色表現(xiàn)為強(qiáng)陽性礦化結(jié)節(jié)，提示成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物(牙本質(zhì)涎磷蛋白基因)及其基因表達(dá)產(chǎn)物(牙本質(zhì)涎蛋白)明顯增高，從而進(jìn)一步證明TGF-β3聯(lián)合肝素可促進(jìn)SHED形成牙本質(zhì)分化。

成骨方面的研究，從早期單純骨細(xì)胞的誘導(dǎo)，到目前動物模型的骨缺損修復(fù)，大量的實(shí)驗(yàn)研究證明SHED具有骨誘導(dǎo)能力，為下一步開展臨床治療奠定了基礎(chǔ)。Takahash等人[17]在比較SHED和DPSC成骨能力時(shí)發(fā)現(xiàn)：兩者N-鈣黏著蛋白表達(dá)水平相差不多，而R-鈣黏著蛋白水平DPSC明顯高于SHED。由于R-鈣黏著蛋白的表達(dá)與成骨分化的狀態(tài)有關(guān)，DPSC中表達(dá)R-鈣黏著蛋白水平而不表達(dá)成骨細(xì)胞特異性標(biāo)志物(成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子抗體和骨鈣素)使得SHED比DPSC更能夠分化為成骨細(xì)胞。因此作者認(rèn)為R-鈣黏著蛋白的表達(dá)限制了DPSC的多向分化潛能。

2.4 SHED在其他疾病中的作用

SHED與糖尿病：乳牙牙髓干細(xì)胞在多向分化的基礎(chǔ)上有望對糖尿病的治療開辟一條新途徑。石建峰等人[9]通過重組轉(zhuǎn)錄因子慢病毒載體Lenti-hFOXA2和Lenti-hPDX1誘導(dǎo)SHED，經(jīng)免疫熒光染色顯示細(xì)胞中有胰島素原、轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，在經(jīng)過高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)后細(xì)胞中的胰島素原進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為胰島素。此試驗(yàn)證明誘導(dǎo)后的SHED細(xì)胞具有β細(xì)胞的相關(guān)特性，有望為糖尿病基因治療帶來種子細(xì)胞。對此功能Kanafi等人[18]又做了深入研究，他們通過對糖尿病小鼠皮下移植SHED的球囊，移植后90%小鼠血糖恢復(fù)到正常水平。去除SHED球囊，經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)沒有引起血糖升高，表明內(nèi)源性胰島再生成功。

SHED與肌萎縮：Kerkis等人[19]在研究進(jìn)行性假肥大性肌營養(yǎng)不良狗的模型中發(fā)現(xiàn)注射了SHED狗的肌細(xì)胞內(nèi)檢測到了抗肌萎縮蛋白，這表明SHED對治療肌營養(yǎng)不良有一定效果。基于此結(jié)果Greyson等人[20]進(jìn)一步驗(yàn)證了SHED在治療抗肌萎縮蛋白缺失的小鼠(DMD)作用，他們通過中醫(yī)針灸理論在DMD小鼠膀胱上選取4個(gè)穴位，在4個(gè)穴位中注射SHED培養(yǎng)液并同時(shí)結(jié)合針灸治療，組織學(xué)和免疫組化分析發(fā)現(xiàn)治療組小鼠肌肉力量明顯改善，同時(shí)體內(nèi)肌酐磷酸激酶水平降低，此外在脛骨前肌觀察中發(fā)現(xiàn)抗肌萎縮蛋白增加，再次證明了SHED治療肌萎縮功效，但其具體機(jī)制不清。

SHED促進(jìn)傷口愈合和延緩光老化：Nishino[21]在裸鼠背部傷口愈合時(shí)發(fā)現(xiàn)，SHED組通過增加膠原蛋白的生產(chǎn)使創(chuàng)面愈合速度加快，當(dāng)在堿性成纖維細(xì)胞生長因子的存在下，SHED能更加有效的促進(jìn)傷口愈合。Uedam等[22]在對紫外線光照引起裸鼠皮膚老化的模型中通過皮下注射SHED，發(fā)現(xiàn)能改善因輻射引起的皮膚細(xì)小皺紋，增加真皮厚度。

3 乳牙牙髓干細(xì)胞研究目前面臨的困境

乳牙牙髓干細(xì)胞雖然有多種優(yōu)勢，但也存在一定的局限性。以上實(shí)驗(yàn)研究主要局限在動物模型上，其廣泛的臨床應(yīng)用尚待檢驗(yàn)。而且乳牙牙髓干細(xì)胞的增殖能力有限，他們經(jīng)過有限的體外培養(yǎng)后趨于衰老，只有相對少量的自體SHED可從每個(gè)乳牙中分離，常常需要廣泛的進(jìn)行體外擴(kuò)增使這些細(xì)胞獲得移植和組織工程所需的細(xì)胞數(shù)量。此外，體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化成所需的細(xì)胞是治療關(guān)鍵的一步，但在基因重編改造方面尚缺乏相關(guān)安全的病毒載體，以至于表達(dá)不正常細(xì)胞標(biāo)志物，如OCT4，SOX2和MYC。低溫冷凍乳牙牙髓干細(xì)胞也存在著牙髓分離率和增殖率降低的問題，Hyo-Seol Lee等[23]研究顯示，冷凍保存3個(gè)月的乳牙與新鮮的牙齒相比牙髓分離成功率為70%，然而，冷凍3～9月導(dǎo)致成功率僅40%。這表明，增加冷凍保存期減少了牙髓的分離成功率。Lindemann等人[6]還發(fā)現(xiàn)隨著保存時(shí)間延長，SHED的培養(yǎng)及增殖率也隨之降低，并出現(xiàn)細(xì)胞的死亡或凋亡。

4 展 望

乳牙牙髓干細(xì)胞因?yàn)榫哂休^強(qiáng)的增殖能力和多向分化潛能，大量臨床前動物模型實(shí)驗(yàn)已證明，SHED在治療包括神經(jīng)脊髓損傷、骨缺損、成牙本質(zhì)、傷口愈合、肌肉萎縮等疾病中具有顯著療效。2015年7月，我國首家GMP級乳牙干細(xì)胞庫在“世界口腔干細(xì)胞之父”施松濤教授努力下落戶北京，標(biāo)志著我國在研究乳牙干細(xì)胞邁入新的一步。乳牙干細(xì)胞庫的建立為更好的保存和應(yīng)用SHED提供了基礎(chǔ)。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法的不斷進(jìn)步、完善，將乳牙牙髓干細(xì)胞應(yīng)用于臨床將會極大地促進(jìn)口腔醫(yī)學(xué)乃至人類發(fā)展進(jìn)步。

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陳文峰(1990—)，男，本科，主要從事口腔醫(yī)學(xué)研究。

石運(yùn)芝，E-mail: yzshi@tsmc.edu.cn。

R78

A

1004-7115(2017)01-0117-04

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2016-06-10)