王富貴（山東省安丘市金冢子畜牧獸醫(yī)管理站 262100）

豬場大腸桿菌滅活苗的制備與免疫效果觀察

王富貴（山東省安丘市金冢子畜牧獸醫(yī)管理站 262100）

本研究從惠豐豬場發(fā)病仔豬中分離到致病性大腸桿菌，并對血清型菌株O64、O9、O149進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)甲醛滅活，以鋁膠佐劑，制成滅活菌，經(jīng)檢驗(yàn)該疫苗合格，對同型菌的攻毒保護(hù)率80%。

大腸桿菌、仔豬、免疫

仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一組腸道傳染性疾病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病三種，以發(fā)生腸炎、腸毒血癥為特征，主要發(fā)生在0～70日齡的仔豬[1]。大腸桿菌屬于條件性致病菌，當(dāng)環(huán)境因素惡劣或機(jī)體抵抗力下降時，容易引發(fā)該病發(fā)生，尤其是冬季，天氣寒冷，氣溫劇變，保溫不良，空氣流通不暢，更易引發(fā)此病，造成新生仔豬大批死亡或生長發(fā)育不良，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，給養(yǎng)豬戶造成巨大的損失[2]?；葚S豬場，母豬群5500頭，存欄量47000頭，品種為長白、大約克和杜洛克, 年產(chǎn)仔豬約120000頭。2015年該豬場豬群健康，年出欄量10萬頭，說明該豬場免疫程序在2015年前都對預(yù)防大腸桿菌病起到過一定的作用。2016年，該豬場突然暴發(fā)仔豬黃白痢病，主要表現(xiàn)為一窩仔豬出生時體況正常，于12h之后，突然有一兩頭表現(xiàn)全身衰竭，很快死亡。以后其他仔豬相繼發(fā)生腹瀉，糞便呈黃色漿狀，含有凝乳小片。有的轉(zhuǎn)為拉灰白色粘稠糞便為特征[3]，致使仔豬發(fā)育停滯、消瘦、抵抗力下降。惠豐豬場也曾用疫苗預(yù)防和藥物治療仔豬黃白痢，但效果不佳。為此，從該豬場分離篩選出致病性大腸桿菌株制成鋁膠苗用于該豬場后，仔豬黃白痢得到有效的控制。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）用滅菌棉簽從該場典型黃白痢病仔豬肛門拭取20個糞樣，置無菌試管中作為病料。（2）麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所試劑廠)產(chǎn)品型號：20151224，20種大腸桿菌0抗原單價血清(中監(jiān)所)，腸桿菌科生化編碼鑒定管，鋁膠佐劑(浙江省軍區(qū)后勤部衛(wèi)生防疫檢疫所)產(chǎn)品型號：20160104。

1.2 試驗(yàn)動物

15～18日齡小鼠20只，健康家兔10只(杭州市蕭山區(qū)獸醫(yī)衛(wèi)生防疫站)，免疫與非免疫2日齡仔豬各15只，妊娠母豬90頭(惠豐豬場)均為3胎內(nèi)的年輕母豬)。

1.3 純菌株的制備

取病料分別于麥康凱和伊紅美藍(lán)瓊脂平板劃線，經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24 h后，從麥康凱瓊脂平板上鉤取單個粉紅色、圓形、稍隆起、邊緣整齊、表面光滑的中等大小菌落或從伊紅美藍(lán)瓊脂上挑取紫黑色、帶金屬光澤閃亮的疑似菌落，涂片，革蘭氏染色，油鏡鏡檢。將檢出兩端鈍圓的G﹣短小桿菌再接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18～24h，重復(fù)2～3次，確認(rèn)無雜菌后后分別移至瓊脂斜面上，作為純菌種[4]。

1.4 菌種鑒定

1.4.1 生化試驗(yàn) 參考獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)的方法，將個菌株分別接種于葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖等糖的發(fā)酵生化管中做糖發(fā)酵試驗(yàn)；同時菌株分別做三糖鐵試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、M．R．試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)，設(shè)對照組并記錄結(jié)果。

1.4.2 致病性試驗(yàn) 將生化鑒定后的菌株分別接種于普通肉湯，37℃培養(yǎng)18h后備用。取15～18g健康小鼠10只，分成兩組，試驗(yàn)組和對照組個5只小鼠，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射0.2ml疑似分離菌株肉湯培養(yǎng)液，對照組不注射，兩組隔離飼養(yǎng)觀察，每6h觀察小鼠情況，選擇致病小鼠的大腸桿菌菌株為該場致病菌株[5]。

1.4.3 血清型鑒定 待檢菌株的處理：將純化的待檢菌液涂布于普通瓊脂平板上，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18h后，用適量5g?L石炭酸生理鹽水洗下菌苔，制成濃稠菌懸液；121℃高壓滅菌2h，破壞K抗原后即為待檢菌的O抗原，4℃保存?zhèn)溆肹6]。血清學(xué)鑒定：按照鑒定血清說明書分別做玻板凝集和試管凝集實(shí)驗(yàn)，鑒定惠豐豬場豬大腸桿菌致病菌株血清型。

1.5 大腸桿菌滅活苗的制備

1.5.1 擴(kuò)菌培養(yǎng) 用接種環(huán)分別鉤取適量不同血清型的菌株，劃線于營養(yǎng)瓊脂平板表面，在37℃條件下培養(yǎng)24h后，以滅菌生理鹽水洗下制成懸濁液[7]；再取懸濁液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板表面，在37℃條件下培養(yǎng)24h，以滅菌生理鹽水洗下菌落。分別置于滅菌瓶中，用麥?zhǔn)媳葷峁芊y定其含菌數(shù)，使各血清型的菌液含菌數(shù)相等[8]。

1.5.2 滅活 將不同血清型的菌株培養(yǎng)液混合，以滅菌生理鹽水稀釋至含細(xì)菌總數(shù)為200億/ml。加入甲醛溶液使其在菌液中的最終濃度為0.5%，37℃滅活24～48h，其間振蕩數(shù)次。再加入等菌液體積20%滅菌氫氧化鋁膠，最后加入柳硫汞使最終濃度為0.01%，混勻、檢驗(yàn)、分裝。

1.6 惠豐豬場大腸桿菌滅活苗的檢驗(yàn)

1.6.1 性狀和無菌檢驗(yàn) 肉眼直接觀察滅活苗性狀；混勻并取適量滅活苗，均勻涂布于麥康凱瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)72h后觀察及顯微鏡檢查。

1.6.2 安全性檢查 取10只小白鼠，分別皮下注射菌苗0.5ml/只，連續(xù)觀察7d；取10只家兔，皮下注射滅活苗2ml/只，觀察7d，期間每4h測1次體溫；妊娠母豬10頭，產(chǎn)前15d，肌肉注射4ml/頭，連續(xù)觀察20d。

1.6.3 攻毒試驗(yàn) 隨機(jī)選取免疫母豬和非免疫母豬所產(chǎn)2日齡仔豬各l5頭，分別用制苗細(xì)菌懸液，按100億/頭進(jìn)行攻毒，觀察仔豬哺乳期內(nèi)的生長情況，記錄仔豬發(fā)生黃白痢的頭數(shù)和死亡情況，測定其對仔豬的保護(hù)率。

1.7 滅活苗的應(yīng)用試驗(yàn)

1.7.1 試驗(yàn)對象 惠豐豬場，選擇健康的妊娠母豬80頭，隨機(jī)分為4組。

1.7.2 免疫方法 第一組用本滅活苗免疫，妊娠母豬產(chǎn)前40d和15d分別肌肉注射，4ml/頭。第2組用本滅活苗免疫，妊娠母豬產(chǎn)前40d和15d分別肌肉注射，2ml/頭。第3組用市售大腸桿菌多價滅活苗進(jìn)行免疫作對照。第4組不免疫作為對照。

1.7.3 效果判定 每天觀察試驗(yàn)?zāi)肛i所產(chǎn)仔豬，記錄哺乳期內(nèi)仔豬黃白痢的發(fā)生情況和仔豬發(fā)育情況，綜合判定滅活苗的免疫效果。

2 結(jié)果

2.1 糖發(fā)酵與生化試驗(yàn)結(jié)果

各菌均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖 甘露醇，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；少數(shù)菌株發(fā)酵蔗糖，只產(chǎn)酸或產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；M．R．試驗(yàn)陽性；V-P試驗(yàn)陰性；產(chǎn)生靛基質(zhì)；尿素酶試驗(yàn)陰性；硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性；吲哚試驗(yàn)陽性；枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性；三糖鐵斜面、底層產(chǎn)酸變黃，有氣體，無變黑現(xiàn)象。從惠豐豬場共分離到致病性大腸桿菌17株，用玻片凝集法進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果為：O64(7株)，O9(4株)，0149(5株)，一株未知。

2.2 無菌檢驗(yàn)

滅活苗靜置后分層，上層為澄清液體，下層為乳白色沉淀物，振搖混勻呈均一渾濁液；麥康凱培養(yǎng)基上無菌生長。

2.3 安全性檢查

試驗(yàn)用的10只小白鼠、10只家兔觀察7d均無異常；產(chǎn)前15d妊娠母豬注射后部分母豬有一過性的厭食反應(yīng)，注射部位輕微紅腫，無其他不良反應(yīng)，胎兒、新生仔豬在哺乳期內(nèi)均正常。

2.4 攻毒試驗(yàn)

攻毒試驗(yàn)結(jié)果見表1。

由表1可以看出攻毒后免疫組新生仔豬在哺乳期內(nèi)發(fā)病3頭，其中2頭死亡，死亡率和致死率分別為13.35%、66.67%；攻毒后對照組新生仔豬在哺乳期內(nèi)發(fā)病13頭，其中7頭死亡，死亡率和致死率分別為46.46%、61.62%。對比差異顯著，說明滅活苗對哺乳期內(nèi)的新生仔豬具有較好的保護(hù)作用。

2.5 應(yīng)用試驗(yàn)

惠豐豬場大腸桿菌滅活苗在豬場免疫試驗(yàn)結(jié)果見表2

表2說明4個組的臨床發(fā)病及死亡情況，2組全期發(fā)病率為15.42%，較1、4組分別下降了8.46%和24.09% ，經(jīng)X2檢驗(yàn)組間差異顯著(P<0.05)；2組全期死率為6.07%，較4組下降了10.51%，組間差異極顯著(P<0.01)，較一和3組分別下降了3.88%和1.55% ，組間差異顯著(P<0.05)，說明該滅活苗免疫效果良好。

3 討論

3.1 試驗(yàn)結(jié)果分析

從應(yīng)用試驗(yàn)結(jié)果可以看出：用4ml/頭量本豬場大腸桿菌滅活苗時免疫效果較市售疫苗效果好，市售疫苗預(yù)防免疫接種效果較空白組也很明顯的，故單從實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷此次仔豬大腸桿菌病的暴發(fā)并非市售疫苗的質(zhì)量問題。其發(fā)病原因可有以下可能：（1）預(yù)防接種時，疫苗劑量達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn),造成母豬抗體水平不高致使仔豬所獲得的母源抗體水平也相對較低,不足以抵抗外界存在的病毒侵襲。（2）日常消毒工作不嚴(yán)格與外界環(huán)境隔離工作沒做好，導(dǎo)致發(fā)病。（3）母豬營養(yǎng)水平低，新生仔豬吃初乳太遲或食入量太少，導(dǎo)致體內(nèi)抗體水平低導(dǎo)致發(fā)病。四是自然界中大腸桿菌血清型(O抗原型)多達(dá)數(shù)萬種，某一血清型的大腸桿菌的抗體對其相應(yīng)血清型的大腸桿菌免疫效果最好，而對其它血清型的大腸桿菌免疫效果不一。

綜上所述，本次惠豐豬場仔豬大腸桿菌病的暴發(fā)原因是多方面的，只有更加嚴(yán)格的執(zhí)行好各種疾病的免疫程序，做好各種衛(wèi)生消毒及管理工作，減少環(huán)境誘因和應(yīng)激反應(yīng)才能有效的預(yù)防各種疾病，給豬場帶來更大的效益。

3.2 惠豐豬場發(fā)病的原因及補(bǔ)救措施

（1）仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌引起的一組腸道傳染性疾病，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)生產(chǎn)的健康發(fā)展，對規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)的危害尤為嚴(yán)重[9]。但大腸埃希氏菌易產(chǎn)生耐藥性，且常呈多重耐藥，藥物治療費(fèi)用較高且效果不佳，應(yīng)該預(yù)防為主。大腸埃希氏菌的血清型較多，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的致病性大腸埃希氏菌血清型數(shù)量近百余種，不同地區(qū)豬場的菌型不盡相同，不同血清型菌株的抗原種類不同。因此，不同血清型之間的交叉免疫能力較弱，使用普通疫苗，往往因菌型差異起不到有效的預(yù)防效果，免疫結(jié)果很不理想。因此，從特定豬場分離出的致病性大腸埃希氏菌優(yōu)勢血清型菌株制成滅活苗，免疫該豬場妊娠母豬，可較好地預(yù)防仔豬黃白痢的發(fā)生，提高仔豬成活率，它克服了普通疫苗由于血清型差異而造成的免疫效果不佳[10]。（2）仔豬大腸桿菌病是由致病性大腸桿菌感染所致，也與仔豬的抵抗力、環(huán)境及飼養(yǎng)管理密切相關(guān)。因此，除采用合適的疫苗及時進(jìn)行免疫接種外，還應(yīng)注意加強(qiáng)日常的衛(wèi)生、飼養(yǎng)管理，減少環(huán)境誘因和應(yīng)激反應(yīng)；做好母豬產(chǎn)前補(bǔ)硒和仔豬產(chǎn)后補(bǔ)鐵與補(bǔ)硒工作；確保保育舍內(nèi)一定的保溫和干燥效果；對已發(fā)病的豬應(yīng)及時做好隔離消毒，及時治療，達(dá)到綜合防治的目的。

3.3 免疫接種的技術(shù)要求

（1）免疫接種前對使用的疫苗要逐瓶檢查，檢查瓶子有無破損，封口是否嚴(yán)密，瓶簽是否完整，有效期是否已過，有一項(xiàng)不合格均不能使用，做報(bào)廢處理。（2）接種疫苗必須由受過專業(yè)培訓(xùn)的獸醫(yī)技術(shù)人員操作，按規(guī)程進(jìn)行接種。（3）免疫接種用的器材(注射器、針頭、鑷子、稀釋液瓶等)要洗凈并煮沸消毒后方可使用。（4）稀釋后的疫苗溶液要固定一個注射針頭，避免反復(fù)吸取時污染疫苗，要求一豬更換一次針頭。（5）接種疫苗時應(yīng)檢查和了解豬群的疫情，若有嚴(yán)重傳染性疾病流行時，則應(yīng)停止接種，若是個別病豬，應(yīng)剔除，隔離，然后接種健康豬。（6）免疫接種后，特別是在1h內(nèi)，應(yīng)由專人認(rèn)真的檢查豬群中有無過敏或嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng)，同時準(zhǔn)備好腎上腺素等抗過敏藥品，便于及時搶救。（7）注射疫苗前后10d，不應(yīng)飼喂含抗生素的飼料或注射抗菌藥物

4 結(jié)論

對從惠豐豬場發(fā)病仔豬分離到的致病性大腸桿菌血清型菌株O64、O9、O149進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)甲醛滅活，以鋁膠為佐劑，制成惠豐豬場仔豬大腸桿菌滅活苗(含菌量為200億/m1)，該疫苗安全性檢驗(yàn)合格，對同型菌株的攻毒保護(hù)率達(dá)80.00%，對仔豬黃白痢有較好的預(yù)防作用。

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