王雪銀，宋獻(xiàn)美，馬云云

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州451191)

siRNA抑制Caspase-3表達(dá)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響

王雪銀，宋獻(xiàn)美，馬云云

(河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州451191)

目的觀察利用小干擾RNA(siRNA)抑制Caspase-3表達(dá)對(duì)內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的影響。方法針對(duì)Caspase-3的DNA序列843～1 634 bp設(shè)計(jì)引物，常規(guī)分子克隆至慢病毒表達(dá)載體pLenti-7.1，同時(shí)設(shè)置空載體為陰性對(duì)照；利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48 h后收獲抑制Caspase-3表達(dá)病毒質(zhì)粒V-Caspase-3和空載體病毒質(zhì)粒V-control。將肝細(xì)胞HL7702隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，分別加入V-Caspase-3、V-control培養(yǎng)4 h，均與終濃度為20 mg/L的內(nèi)毒素共培養(yǎng)12 h。采用Western blotting 法檢測(cè)Caspase-3蛋白，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡率，原位末端標(biāo)記技術(shù)測(cè)算細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)，MTT法觀察細(xì)胞增殖活力。結(jié)果觀察組HL7702細(xì)胞Caspase-3相對(duì)表量為17.32±2.16，低于對(duì)照組的62.14±4.36(P<0.01)；觀察組HL7702細(xì)胞凋亡率為28.75%，低于對(duì)照組的72.67%(P<0.01)；觀察組HL7702細(xì)胞AI為23.52±1.24，低于對(duì)照組的54.26±1.87(P<0.01)；觀察組HL7702細(xì)胞增殖率為65.47%±6.24%，高于對(duì)照組的41.39%±4.87%(P<0.01)。結(jié)論通過siRNA抑制Caspase-3表達(dá)能有效降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡，從而增強(qiáng)細(xì)胞增殖活性。

小干擾RNA；半胱氨酸蛋白酶3；內(nèi)毒素；肝細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖

肝衰竭是內(nèi)毒素血癥的一個(gè)嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)生率高達(dá)85%[1]，目前臨床缺乏有效治療措施。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的成分，其主要組成部分是脂多糖(LPS)。細(xì)菌內(nèi)毒素可誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡,尤其是肝細(xì)胞代謝旺盛時(shí)最易損傷[2]。研究證實(shí)，Caspase-3 是凋亡過程中最重要的蛋白酶, 是多條凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，同樣也參與了內(nèi)毒素導(dǎo)致的肝細(xì)胞凋亡過程[3,4]。小干擾RNA(siRNA)是對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控最重要的手段，因在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄效率和穩(wěn)定性不佳而限制了進(jìn)一步的開發(fā)利用[5]。慢病毒由于高效的感染效率和體內(nèi)外安全性，已成為新的RNA干擾研究工具。2016年5～12月，我們利用慢病毒介導(dǎo)的siRNA抑制內(nèi)源性的Caspase-3，觀察對(duì)內(nèi)毒素所致肝細(xì)胞凋亡的影響，為臨床治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 正常肝細(xì)胞株HL7702、293T細(xì)胞由本室保存，siRNA慢病毒表達(dá)載體pLenti-7.1及包裝載體購(gòu)自Progema公司，抑制Caspase-3的慢病毒由本室包裝保存，Lipofectamine 2000購(gòu)自Life Technologies公司；Caspase-3一抗、GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司，原位末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)試劑盒購(gòu)自羅氏公司，RIPA裂解緩沖液購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司,BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。 RPMI 1640干粉、四氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自GIBCO公司，LPS(50 mg/瓶)、降脂烷、SDS-PAGE購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自天津TBD公司，胰蛋白酶購(gòu)自華美生物工程有限公司，二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靶向Caspase-3的siRNA序列設(shè)計(jì)及病毒質(zhì)粒的制備 利用生物信息學(xué)工具選取Caspase-3的DNA序列843～1 634 bp設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別為5′-CGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAG-3′和3′-GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATG-5′；常規(guī)分子克隆至慢病毒表達(dá)載體pLenti-7.1，同時(shí)設(shè)置空載體為陰性對(duì)照。利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，48 h后收獲抑制Caspase-3表達(dá)病毒質(zhì)粒V-Caspase-3和空載體病毒質(zhì)粒V-control。

1.2.2 HL7702細(xì)胞分組轉(zhuǎn)染與內(nèi)毒素干擾 取狀態(tài)良好的HL7702細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組；將細(xì)胞接種至12孔板，培養(yǎng)體積為1 mL/孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱過夜。取凍存的V-Caspase-3和V-Control，觀察組和對(duì)照組均滴加滴度為1010的病毒質(zhì)粒5 μL/孔，37 ℃培養(yǎng)4 h后吸棄培養(yǎng)上清，每孔添加培養(yǎng)基1 mL。兩組均添加內(nèi)毒素使終濃度為20 mg/L，37 ℃培養(yǎng)12 h。

1.2.3 HL7702細(xì)胞Caspase-3檢測(cè) 采用Western blotting 法。取1.2.2中內(nèi)毒素處理后培養(yǎng)12 h的兩組細(xì)胞，按照RIPA裂解緩沖液說明提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40 μg細(xì)胞總蛋白進(jìn)行12%的SDS-PAGE電泳，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，抗Caspase-3和GAPDH抗體作為一抗4 ℃孵育過夜；常規(guī)二抗室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3次。采用Odensey激光紅外掃描儀檢測(cè)，以目的蛋白與內(nèi)參條帶的灰度值比值表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 HL7702細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用流式細(xì)胞儀。取1.2.2中內(nèi)毒素處理后培養(yǎng)12 h的兩組細(xì)胞，進(jìn)行胰酶消化離心后收集細(xì)胞入Eppendorf管；用結(jié)合液2 000 μL洗滌1次后,將細(xì)胞懸浮于50 μL結(jié)合液中；加FITC-Annexin V及PI染液各5 μL，混勻后避光冰浴15 min；結(jié)合液洗滌2次后，上流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 HL7702細(xì)胞的凋亡指數(shù)(AI)測(cè)算 采用TUNEL法。取1.2.2中內(nèi)毒素處理后培養(yǎng)12 h的兩組細(xì)胞，以5×105/mL接種于12孔板；將細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS室溫洗3×5 min；每孔細(xì)胞滴加TdT標(biāo)記緩沖液避光室溫孵育60 min，用TdT終止緩沖液室溫作用5 min，PBS室溫洗3×5 min。每孔細(xì)胞滴加1 mL的碘化丙啶溶液，室溫孵育15 min，PBS清洗3×5 min。吸棄細(xì)胞上清，熒光顯微鏡下被染上熒光的為凋亡細(xì)胞,計(jì)算各組平均值即為AI。

1.2.6 HL7702細(xì)胞增殖能力觀察 采用MTT法。 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL7702細(xì)胞隨機(jī)分為觀察組和對(duì)照組，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋為8×105/mL，按每孔100 μL接種于96孔板。觀察組和對(duì)照組分別加入V-Caspase-3和V-Control病毒顆粒0.6 μL/孔,37 ℃培養(yǎng)6 h；兩組均添加內(nèi)毒素使終濃度為20 mg/L，37 ℃培養(yǎng)12 h；每孔添加10 μL MTT(8 mg/mL)，4 h后追加110 μL/孔酸化SDS，12 h后酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)A570。細(xì)胞增殖率=(1-實(shí)驗(yàn)孔A570/對(duì)照孔A570)×100%。

2 結(jié)果

2.1 兩組HL7702細(xì)胞Caspase-3表達(dá)比較 觀察組HL7702細(xì)胞Caspase-3相對(duì)表量為17.32±2.16，低于對(duì)照組的62.14±4.36(P<0.01)。

2.2 兩組HL7702細(xì)胞凋亡率比較 觀察組HL7702細(xì)胞凋亡率為28.75%，低于對(duì)照組的72.67%(P<0.01)。

2.3 兩組HL7702細(xì)胞AI比較 觀察組HL7702細(xì)胞AI為23.52±1.24，低于對(duì)照組的54.26±1.87(P<0.01)。

2.4 兩組HL7702細(xì)胞增殖率比較 觀察組HL7702細(xì)胞增殖率為65.47%±6.24%，高于對(duì)照組的41.39%±4.87%(P<0.01)。

3 討論

內(nèi)毒素可以通過細(xì)菌裂解或黏附在其他細(xì)胞上時(shí)釋放出來[6]，通過激活線粒體依賴途徑和非線粒體依賴途徑誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡。肝臟是體內(nèi)最重要的清除內(nèi)毒素的器官，同時(shí)也最容易受到內(nèi)毒素攻擊而產(chǎn)生損傷。內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝臟損傷是多種肝病的主要病理基礎(chǔ)[7]，可通過引起大量肝細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致肝衰竭。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在一定的環(huán)境下，由遺傳基因控制的適應(yīng)性反應(yīng),也是保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要手段[8]。適度的細(xì)胞凋亡是生理發(fā)育過程中的必要程序，但某些病理?xiàng)l件導(dǎo)致的過度凋亡會(huì)引起嚴(yán)重的病理過程[9]。細(xì)胞凋亡受到多種因素的調(diào)節(jié)，腫瘤壞死因子α、轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子、一氧化氮等生物活性介質(zhì)都能影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞大量凋亡是肝衰竭病理過程中的重要事件。早期的研究[12]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素可以通過Toll 樣受體4激活單核吞噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡；另有研究[13]表明，內(nèi)毒素可以在體外直接誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毒素可以通過激活凋亡受體引起肝細(xì)胞凋亡[14]。內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制現(xiàn)在還不清楚，因此臨床上仍然缺乏有效的治療方法。

細(xì)胞的凋亡程序一旦啟動(dòng)，胞內(nèi)的相關(guān)凋亡蛋白被激活。Caspase酶家族是凋亡激活過程中最重要的蛋白，其成員包括凋亡起始者Caspase-8、9、10和效應(yīng)者Caspase-3。Caspase-3是多條細(xì)胞凋亡信號(hào)的共同下游信號(hào)分子，一旦被激活后，可以通過激活一系列的DNA損傷蛋白導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。我們前期研究也證實(shí)，內(nèi)毒素能夠通過激活Caspase-3誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。因此，干擾內(nèi)源性Caspase-3的功能，減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有望為肝損傷的臨床治療提供一種新的策略。本研究利用具有高效穩(wěn)定的慢病毒表達(dá)系統(tǒng)成功獲得了能夠抑制內(nèi)源性Caspase-3的病毒質(zhì)粒V-Caspase-3，經(jīng)一系列的生物化學(xué)檢測(cè)證實(shí)抑制內(nèi)源性Caspase-3后可有效降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的HL7702細(xì)胞凋亡， 減輕內(nèi)毒素對(duì)HL7702細(xì)胞增殖活力的影響。因此，抑制內(nèi)源性Caspase-3表達(dá)可以有效減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，我們也將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)此觀點(diǎn)，為臨床上治療肝臟損傷提供新的策略。

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Effect of siRNA-induced inhibition of Caspase-3 expression on apoptosis of hepatocytes induced by endotoxin

WANGXueyin,SONGXianmei,MAYunyun

(HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191,China)

ObjectiveTo investigate the effect of siRNA-induced inhibition of Caspase-3 expression on the apoptosis of hepatocytes induced by endotoxin.MethodsPrimers were designed for DNA sequence 843-1634 bp of Caspase-3. The target sequences was cloned into the lentivires expression vector pLenti-7.3 and empty lentivirus vector was set as a negative control. The virus vector and empty vector were transfected into 293T cells with Lipofectamine2000 liposomes. The virus of V-caspase-3 and V-control was harvested after 48 h. The hepatocytes HL7702 were randomly divided into the observation group and the control group, which were cultured with V-caspase-3 and V-control for 4 h, and then both groups were cultured with 20 mg/L endotoxin for 12 h. The protein expression of Caspase-3 was detected by Western blotting. The apoptosis rate of HL7702 cells was tested by flow cytometry (FACS). The apoptosis index (AI) was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labeling (TUNEL). The proliferative activity of cells was determined by MTT.ResultsThe relative expression of Caspase-3 in HL7702 cells of the observation group was 17.32±2.16, which was lower than that in the control group (62.14±4.36) (P<0.01). The apoptotic rate of HL7702 cells in the observation group was 28.75%, which was lower than that of the control group (72.67%) (P<0.01). The AI of the observation group was 23.52±1.24, which was higher than that of the control group (54.26±1.87) (P<0.01). The proliferation rate of HL7702 cells in the observation group was 65.47%±6.24%, which was higher than that of the control group (41.39%±4.87%) (P<0.01).ConclusionInhibition of caspase-3 by siRNA can effectively decrease the level of apoptosis of endotoxin-induced hepatocytes HL7702, thereby enhance the cell proliferation activity.

small interfering RNA; Caspase-3; endotoxin; hepatocytes; apoptosis; cell proliferation

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.003

R575

A

1002-266X(2017)34-0009-03

2017-05-31)

河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目計(jì)劃(15B310006)。

王雪銀(1978-)，女，講師，研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)基礎(chǔ)與臨床。E-mail: Wangxueyin219@163.com