朱艷，暢志堅，張曉軍，李欣，詹海仙，郭慧娟，喬麟軼

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031）

偃麥草屬分子標記開發(fā)研究進展

朱艷1，暢志堅2，張曉軍2，李欣2，詹海仙2，郭慧娟2，喬麟軼2

（1.山西大學生物工程學院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，山西太原030031）

偃麥草具有小麥育種中需要的優(yōu)質(zhì)、抗病、耐鹽堿等諸多優(yōu)良性狀，為充分發(fā)掘偃麥草在提高小麥品質(zhì)和抗性方面的應(yīng)用潛力，列舉了3種偃麥草特異分子標記開發(fā)情況，闡述了其在小麥育種中的應(yīng)用現(xiàn)狀，分析了開發(fā)偃麥草分子標記技術(shù)存在的問題，以期促進偃麥草分子標記更好地應(yīng)用于小麥遺傳育種。

偃麥草；育種應(yīng)用；標記開發(fā)

偃麥草屬（Thinopyrum）植物是禾本科小麥族（Triticeae）多年生草本植物，世界范圍內(nèi)約有50種偃麥草屬植物，我國現(xiàn)有長穗偃麥草（Th.elongatatum）、中間偃麥草（Th.intermedia）、茸毛偃麥草（Th. trichophora）、硬葉偃麥草（Th.smithii）等[1]。偃麥草屬植物因具有抗寒、抗旱、耐鹽堿、品質(zhì)優(yōu)良等性狀而多被用來作飼草，也是防風固沙、水土保持的理想植物[2-3]。該屬植物是小麥的三級基因庫，具有小麥缺乏的優(yōu)良基因及性狀，同時它與小麥的染色體組相近，且易于小麥雜交，因而，被廣泛應(yīng)用于小麥抗病育種[4]。偃麥草中的E基因組是小麥族中很重要的一個基本基因組，該基因組包含Ee和Eb2個亞基因組。依據(jù)系統(tǒng)分類學研究，推斷Ee和Eb基因組的真正供體分別是Th.elongatum（2n＝2X＝14，EeEe）[5]和Th.bessarabicum（2n＝2X＝14，EbEb）[6]。目前應(yīng)用最多的是長穗偃麥草、百薩偃麥草、中間偃麥草，在小麥的抗病和品質(zhì)改良上充分體現(xiàn)了其價值。

分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展使得在分子水平上檢測外源遺傳物質(zhì)成為可能。其中，分子標記技術(shù)被廣泛用于小麥異源種質(zhì)的鑒定、小麥異染色體系尤其是小片段易位系的選擇[7]以及分子標記輔助選擇育種[8]。偃麥草染色體包含大量的抗性和品質(zhì)相關(guān)基因，基于基因組開發(fā)特異分子標記，將極大促進偃麥草優(yōu)異性狀的發(fā)掘、鑒定與利用，加快小麥抗性育種進程。

1 幾種重要偃麥草的特異標記開發(fā)現(xiàn)狀

1.1 長穗偃麥草標記

長穗偃麥草（Th.elongatum（Host）D.R Dewey）與小麥親緣關(guān)系較近，E基因組與小麥A，B，D基因組的遺傳分化程度較小。長穗偃麥草通常有二倍體、四倍體、十倍體3種類型，二倍體長穗偃麥草的Ee基因組是該物種的基本基因組，也有人認為存在六倍體長穗偃麥草[9]。長穗偃麥草基因組中蘊含著豐富的抗病、抗寒、抗旱、耐鹽堿等優(yōu)良基因，其染色體7EL或7ES上[10]、1E[11]染色體臂上發(fā)現(xiàn)了抗赤霉病基因，它是提高小麥生物和非生物脅迫耐受性的一個重要的潛在基因供體?；谄渲T多優(yōu)良性狀，因此，較早地育成了一套完整的小麥-長穗偃麥草二體附加系和代換系。

早在1998年，劉樹兵等[9]已經(jīng)通過長穗偃麥草與普通小麥間的多態(tài)性及E組染色體的特異RAPD標記研究中，以中國春、長穗偃麥草及其7個二體附加系為材料，獲得了3個長穗偃麥草染色體特異RAPD標記OPE-051300，OPF-03700和OPF-15400，分別位于1E和3E染色體上。尤明山等[5]用40對小麥SSR引物對17份偃麥草、2份小麥材料PCR擴增分析后，篩選到Xgwm325-100 bp是Ee染色體組的特異SSR標記。陳國躍等[12]首次獲得了一套完整的分子標記。張超[13]利用11條引物，共獲得除2E外分布于其余6條長穗偃麥草染色體特異片段74條，其中，1E，3E，4E，5E，6E，7E分別為7，7，15，19，9，17條。3類引物組合為ISSR，IRAP和REMAP等3種類型，并將位于5E以及7E染色體上的共3個E染色體特異片段轉(zhuǎn)換為特異PCR標記。朱雪[14]用11條引物，共獲得45條特異片段，分布于長穗偃麥草6條染色體（除2E）上，其中，1E，3E，4E，5E，6E，7E分別有6，3，8，11，8，9條，這些條帶屬于ISSR，IRAP和REMAP等3種類型。并將位于1E（Z34-IE200），4E（Z8-4E374），6E（Z17-6E199）以及7E（Z31-7E215）染色體上的4個特異片段轉(zhuǎn)換為SCAR標記。葛江燕等[15]基于抑制消減雜交（SSH）篩選出36個長穗偃麥草特異分子標記。陳士強等[16]基于SLAF-seq技術(shù)，共開發(fā)了48個長穗偃麥草特異分子標記，基因組特異分子標記2個，1E染色體特異分子標記20個，其他染色體的特異標記26個，包括17個僅出現(xiàn)在1E和5E染色體上。秦樹文等[17]依據(jù)TRAP技術(shù)，獲得30個長穗偃麥草特異SCAR標記，其中具有單條、2條和全基因組染色體特異SCAR標記個數(shù)分別為18，9，3個。CHEN等[18]根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄酶以及大麥BARE-1和水稻RIRE-1中的長末端重復(fù)序列保守區(qū)域設(shè)計的11個引物組合，得到145個分布在長穗偃麥草的全部7條E染色體上的ISSR，IRAP，REMAP等3種類型的特異性片段。經(jīng)與小麥序列同源性比對后，將其中13個長穗偃麥草特異染色體標記然后轉(zhuǎn)換成SCAR標記。

1.2 百薩偃麥草標記

百薩偃麥草（Th.bessarabicum L?ve，2n＝2X＝14）為海岸禾草，多生長于歐洲波羅的海和地中海沿岸。百薩偃麥草除抗小麥梭條花葉病、赤霉病、線蟲等，還具有耐鹽、耐銅、耐鋁、耐重金屬等優(yōu)良性狀[19]。目前，研究最多的是它的耐鹽性。人們首先合成了普通小麥中國春-百薩偃麥草雙二倍體（2n＝8X＝56），簡稱為Tritipyrum，以期轉(zhuǎn)移和利用其耐鹽基因，又相繼獲得異附加系、異代換系、易位系等小麥親緣物種的異染色體系[20]。

KING等[21]獲得了5J染色體上10個特異RAPD標記，利用基因組原位雜交法，將其中6個定位在短臂上，4個定位在長臂上。ZHANG等[6]篩選出一套中國春-百薩偃麥草二體附加系的AFLP和RAPD標記，并利用GISH技術(shù)證實，其中48，67，39，59，54個AFLP標記分別可以追蹤1J，2J，4J，5J和7J染色體。陳華鋒等[20]篩選出30個特異分子標記可追蹤百薩偃麥草染色質(zhì)，其中可以特異追蹤CH05，CH09和CH03等二體附加系中的百薩偃麥草染色體的特異分子標記5，4，2個，同時篩選出3個標記可以特異追蹤CH12和CH11中的易位染色體，還篩選出5個STS，3個RFLP探針和5個SSR共13個標記，并推斷可以特異追蹤4J，5J染色體。達瓦頓珠[22]利用一套中國春-百薩偃麥草附加系，篩選出2個4J染色體特異標記，XZ564和Xwmc233，且將其初步定位在4JS；篩選出8個5J染色體特異標記，根據(jù)8個標記在單體附加系MA5J自交后代的擴增結(jié)果分析，推斷其中的一個標記Xedm46位于5JL，其他7個標記位于5JS。同時還篩選4個特異標記能追蹤百薩偃麥草其他染色體，能特異追蹤1J的標記為XZ507，XZ505，XZ476，能特異追蹤7J的標記為Xedm144。李晨旭等[23]結(jié)合RNA-seq技術(shù)，通過其EST-PCR產(chǎn)物在普通小麥中國春、百薩偃麥草和中國春-百薩偃麥草雙二倍體中的擴增分析，共定位了198個百薩偃麥草特異標記，分別位于染色體1J（31），2JS（15），2JL（26），3JS（20），4JS（12），4JL（12），5J（27），6JS（13），6JL（22）和7JS（20）上。

1.3 中間偃麥草標記

中間偃麥草（Th.intermedium，2n＝6X＝42）是個部分同源-異源六倍體物種，其中，2個染色體組可能源于二倍體百薩偃麥草（Th.bessarabicum，2n＝2X＝14，EbEb）和二倍體長穗偃麥草（Th.elongatum，2n＝2X＝14，EeEe）；另外一個染色體組原始供體可能為擬鵝觀草（Pseudoroegneiria strigosa，2n＝4X＝28，StStStSt），與小麥親緣關(guān)系較遠。一般將中間偃麥草染色體組構(gòu)成表示為EeEeEbEbStSt或者JJJSJSStSt[24]。中間偃麥草對小麥白粉病、銹病、黑穗病、根腐病、黃矮、葉枯病、條紋花葉病和赤霉病等多種病害免疫或高抗，因其生命力強，適應(yīng)性廣，分布于世界上諸多國家，是偃麥草屬中最早與小麥雜交成功的近緣物種[25]。迄今，已經(jīng)選育出多個小麥-中間偃麥草異附加系、異代換系和易位系[4，26]。

尤明山等[27]篩選到一個中間偃麥草染色體組特異標記，并將該標記進一步轉(zhuǎn)化為偃麥草染色體SCAR標記。張增艷等[28]獲得了中間偃麥草St染色體組特異RAPD和SCAR標記。崔志富等[7]在中間偃麥草2Ai-2染色體的短臂上定位到抗黃矮病基因，將3個RFLP探針序列轉(zhuǎn)化為STS126，STS131和STS112標記可用于追蹤2Ai-2染色體。崔雨等[29]利用RNA-seq技術(shù)設(shè)計EST-SSR引物，對普通小麥、中間偃麥草及其基因組供體二倍體長穗偃麥草、百薩偃麥草、假鵝觀草進行擴增分析，從而篩選鑒定出中間偃麥草基因組特異標記。

2 偃麥草屬特異分子標記的應(yīng)用

迄今為轉(zhuǎn)移普通小麥野生近緣種屬的優(yōu)良基因，通過遠緣雜交及染色體工程技術(shù)，已完成了普通小麥與10多個近緣屬、80多個種的遠緣雜交[19]。偃麥草作為其中一個重要野生近緣種，從中發(fā)掘、轉(zhuǎn)移和利用諸多優(yōu)良基因，從而改良小麥品種，拓寬小麥遺傳基礎(chǔ)[4，26]。常規(guī)上通過對遠緣雜交后代進行選擇，獲得具有目標性狀的小麥單株，該方法難度大、周期長。而憑借DNA分子標記不但可以檢測外源遺傳物質(zhì)的存在與否以及外源種質(zhì)資源的多樣性，而且利用遺傳群體還能明確分子標記與外源基因的連鎖關(guān)系，大大提高了選擇準確度和育種效率[30]。KING等[21]結(jié)合GISH技術(shù)，利用RAPD鑒定出5JL和5JS端體附加系、5AS·5JL易位系等。王瑞晶等[31]依據(jù)偃麥草EST序列中SSR的總體特征，獲得了64個具有多態(tài)性的偃麥草EST-SSR標記，其結(jié)果可應(yīng)用于偃麥草重要性狀關(guān)聯(lián)分析、遺傳多樣性研究分析。閆紅飛等[32]對來源于長穗偃麥草的小麥抗葉銹基因Lr19開發(fā)分子標記，建立了與Lr19共分離的穩(wěn)定的SCAR標記Y19SCAR982，對120個小麥品種檢測的結(jié)果表明，該標記可有效應(yīng)用于小麥抗葉銹分子輔助選擇育種。

3 問題與展望

目前，國內(nèi)外開展了大量小麥與近緣種屬的遠緣雜交工作，獲得了許多異源附加系、代換系和易位系，由于當前基因組原位雜交（GISH）等細胞學技術(shù)在跟蹤檢測外源遺傳物質(zhì)方面存在一定的局限性，限制了上述材料的深度利用。因此，發(fā)展快速、有效的檢測技術(shù)，有助于推動遠緣雜交、染色體工程育種的發(fā)展，同時在小麥種質(zhì)資源的創(chuàng)制與鑒定上意義深遠。當前小麥和偃麥草基因組的全序列結(jié)果未公開，加之小麥和偃麥草的基因組序列的同源性較高，利用AFLP，RFLP，RGAP，SSR和RAPD標記技術(shù)開發(fā)的一些偃麥草特異分子標記普遍存在成本高、周期長、效率低、穩(wěn)定性低、重復(fù)性和特異性不強等缺點[33]。同樣是二倍體長穗偃麥草染色體1E-7E特異標記，用42個RGAP引物組合擴增共獲得特異RGAP標記30個[12]，用5對AFLP引物組合擴增共獲得AFLP標記28個[34]，在效率上有所提高，但是轉(zhuǎn)化成STS標記的只有4個[15]。因此，高效利用偃麥草優(yōu)良性狀的關(guān)鍵是開發(fā)新的操作簡單、快速、經(jīng)濟和有效的分子標記。

TRAP技術(shù)[17]與RAPD，SSH，AFLP，SLAF-seq比較，其優(yōu)勢在于設(shè)計引物不是隨機的，是依據(jù)已有EST序列利用引物設(shè)計軟件所得，同時最終的多態(tài)性標記與表現(xiàn)型的相關(guān)性相對較高。同時利用TRAP技術(shù)開發(fā)的長穗偃麥草特異SCAR標記，具有特異性強、穩(wěn)定性好、擴增結(jié)果簡明易讀的特點，可用于小麥背景中不同材料和不同世代中長穗偃麥草染色體的跟蹤和鑒定[17]。RNA-seq技術(shù)是以數(shù)字化信號檢測物種的整體轉(zhuǎn)錄活動，同時還具有成本低、周期短、高通量等優(yōu)勢，為快速開發(fā)親緣物種特異分子標記提供了豐富的序列信息，是目前開發(fā)大量特異分子標記的有效工具，這一技術(shù)在分子標記開發(fā)和分子機理研究方面應(yīng)用越來越廣泛。目前一項利用RNA-seq技術(shù)開發(fā)的百薩偃麥草特異標記的研究中，得到的標記在鑒定小麥-百薩偃麥草小片段易位系或漸滲系、染色體物理作圖中具有很大的應(yīng)用潛力[23]。

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Research Progress of Molecular Markers Development inThinopyrum

ZHUYan1，CHANGZhijian2，ZHANGXiaojun2，LI Xin2，ZHANHaixian2，GUOHuijuan2，QIAOLinyi2
（1.College ofBiological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Institute ofCrop Sciences，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，KeyLaboratoryofCrop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，MinistryofAgriculture，Taiyuan 030031，China）

Thinopyrum has manyexcellent traits,such as high quality,disease resistance and salinity,which are urgentlyneeded in wheat breeding.To fully exploit the potential of Thinopyrum in improving the quality and resistance of wheat,the paper enumerates the development of specific molecular markers for three kinds of Thinopyrum,the paper expounds its application in wheat breeding,and analyzes the existingproblems about the development technologyfor Thinopyrum,soas topromote the Thinopyrum molecular markers for be better applyingin the genetic breedingofwheat.

Thinopyrum;breedingapplication;marker development

Q943.2

A

1002-2481（2017）04-0659-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.41

2016-12-01

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFD0102004-07）；山西省青年基金項目（2015021145）；山西省自然科學基金項目（20150311001-1）；山西省國際合作項目（201603D421003）；山西省農(nóng)業(yè)科學院攻關(guān)項目（15YGG01，YGG1602）

朱艷（1992-），女，山西朔州人，在讀碩士，研究方向：種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用。喬麟軼為通信作者。