陳 俊， 馬雨?yáng)|

(江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科， 江蘇 南通 226000)

探討RhD陰性表型中個(gè)體D基因多態(tài)性研究

陳 俊， 馬雨?yáng)|

(江蘇省南通大學(xué)附屬醫(yī)院輸血科， 江蘇 南通 226000)

目的：探討RhD陰性表型中個(gè)體D基因的多態(tài)性。方法：隨機(jī)抽取2014年11月至2015年10月采集的135例無(wú)親緣關(guān)系的RhD陰性血液樣本作為研究對(duì)象。采用抗人球蛋白試驗(yàn)(又稱Coombs試驗(yàn))來(lái)檢測(cè)RhD陰性表型個(gè)體，并運(yùn)用序列特異引物引導(dǎo)的PCR反應(yīng)(簡(jiǎn)稱PCR-SSP方法)對(duì)RhD陰性表型中個(gè)體基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行分析與統(tǒng)計(jì)。結(jié)果：135例經(jīng)Coombs試驗(yàn)檢測(cè)為陰性表型個(gè)體中，檢測(cè)結(jié)果顯示為外顯子完全缺失有75例，占比55.56%(75/135)，外顯子部分缺失29例，占比21.48%(29/135)，外顯子完整31例，占比22.96%(31/135)；采用PCR-SSP法進(jìn)行基因分型，RHD基因完整中RhD(1227A)占比16.30%(22/135)，弱D15型占比0.74%(1/135)，RHD陽(yáng)性占比5.19%(7/135)；檢測(cè)RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D占比5.93%(8/135)，DVa(Has)占比0.741%(1/135)，DVIⅢ占比0.74%(1/135)。結(jié)論：我國(guó)RhD陰性人群的RhD基因基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多態(tài)性特征，且不同地區(qū)的人群有著相同的Rh血型遺背景，今后可以嘗試采用血清學(xué)與基因分型聯(lián)合方法檢測(cè)RhD陰性中的D抗原。

RhD陰性； 個(gè)體D基因； 多態(tài)性

Rh血型包括54種抗原抗體系統(tǒng)，而與臨床醫(yī)療有密切聯(lián)系的有5種，它們是。相對(duì)于其他4種抗原，D抗原具有較強(qiáng)的免疫原性，因此D抗原是臨床上最重要的抗原體。目前，有許多國(guó)內(nèi)外研究表明，具有種族差異的血液在Coombs試驗(yàn)中檢測(cè)為RhD陰性表型個(gè)體中仍發(fā)現(xiàn)RhD基因，表明RhD陰性個(gè)體因種族不同而有所差異，同時(shí)具有基因多態(tài)性特征[1]。如果人體血液紅細(xì)胞中包含Rh凝集原，則是Rh陽(yáng)性血，不包含Rh凝集原，則是Rh陰性血。這使得紅細(xì)胞A、B、O和AB四種血型又分別被一分為二地劃分為Rh陽(yáng)性血與Rh陰性血。隨著對(duì)Rh血型的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)Rh血型是人體紅細(xì)胞血型中最復(fù)雜的一個(gè)血型系統(tǒng)。據(jù)有關(guān)研究表明，99.7%的中國(guó)漢族及大部分少數(shù)民族人血液屬于Rh陽(yáng)性血[2]。在我國(guó)，僅有3‰～4‰的人群血液屬于RH陰性血型。因此RH陰性血型被稱為“熊貓血”，是一種非常罕見(jiàn)的血型。Rh陰性血型的發(fā)現(xiàn)，有利于醫(yī)學(xué)上更加科學(xué)地開(kāi)展輸血工作?，F(xiàn)隨機(jī)抽取2014年11月至2015年10月我血站中心采集的135例無(wú)親緣關(guān)系的RhD陰性血液樣本作為研究對(duì)象，探討RhD陰性表型中個(gè)體D基因的多態(tài)性。具體研究報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 血樣資料:隨機(jī)抽取2014年11月至2015年10月我血站中心采集的135例無(wú)親緣關(guān)系的RhD陰性血液樣本作為研究對(duì)象，血液樣本10mL/份，獻(xiàn)血自愿者中女55例，男80例，志愿者年齡19～51歲，平均年齡(35±1.06)歲。

1.2 方 法

1.2.1 血清學(xué)方法:對(duì)135例RhD陰性血液樣本進(jìn)行Coombs試驗(yàn)。采用混合抗試劑對(duì)RhD陰性血液樣本進(jìn)行篩選，采用三種不同廠家提供的抗血清試劑與樣本抗血清作對(duì)比，通過(guò)Coombs試驗(yàn)、乙醚放散試驗(yàn)將部分D、Del及弱D等樣本剔除，從而檢測(cè)出真正的RhD血液樣本。

1.2.2 DNA制備:運(yùn)用DNA電泳檢測(cè)法來(lái)制備血樣基因組的DNA。先完成1%濃度的瓊脂糖凝膠板的制備，再進(jìn)行基因組的DNA電泳實(shí)驗(yàn)，接著使用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，然后采用基因組的DNA提取試劑盒(由北京宜科思源科技有限公司提供，貨號(hào)：D3471-00)從所選的RhD血樣標(biāo)本中制備基因組的DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行。

1.2.3 PCR-SSP法基因分型:采用RhD基因檢測(cè)試劑盒(由北京宜科思源科技有限公司提供，貨號(hào)：D4352-08)對(duì)RhD陰性表型中個(gè)體基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)與分析，檢測(cè)RhD陰性等位基因的構(gòu)成。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，銀染后呈現(xiàn)出不同的階梯狀擴(kuò)增片段圖譜。采用凝膠成像儀觀察PCR產(chǎn)物的圖譜特征。

1.3 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):采用Coombs試驗(yàn)檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)RhD陰性個(gè)體中外顯子完全缺失、外顯子部分缺失以及外顯子完整的例數(shù)；采用PCR-SSP法檢測(cè)并統(tǒng)計(jì)RhD陰性個(gè)體中外顯子部分缺失與外顯子完整的等位基因的分布種類(lèi)。

2 結(jié) 果

2.1 RhD陰性表型個(gè)體表現(xiàn):135例RhD陰性血液樣本經(jīng)Coombs試驗(yàn)確認(rèn)為RhD陰性個(gè)體中檢測(cè)結(jié)果顯示為外顯子完全缺失75例，占總數(shù)比例55.56%(75/135)，外顯子部分缺29例，占總數(shù)比例21.48%(29/135)，外顯子完整,31例，占總數(shù)比例22.96%(31/135)。具體如表1所示。

表1 RhD陰性表型個(gè)體情況

2.2 RhD陰性等位基因構(gòu)成情況:采用PCR-SSP法進(jìn)行基因分型，檢測(cè)結(jié)果顯示RHD基因完整中RhD(1227A)22例，占總數(shù)比例16.30%(22/135)，弱D15型1例，占總數(shù)比例0.74%(1/135)，RHD陽(yáng)性7例，占總數(shù)比例5.19%；檢測(cè)RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D8例，占總數(shù)比例5.93%(8/135)，DVa(Has)1例，占總數(shù)比例0.741%(1/135)，DVIⅢ1例，占總數(shù)比例0.74%(1/135)。具體如表2所示。

表2 RhD陰性等位基因構(gòu)成情況

3 討 論

最早的研究提示， RhD陰性個(gè)體中缺失RHD基因，而RhD陽(yáng)性個(gè)體中存在RHD基因[3]。但隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步與研究理論的發(fā)展，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，RhD陰性可能包含多種等位基因，其具有多態(tài)性特點(diǎn)，并因種族差異而呈現(xiàn)不同的遺傳背景。以高加索人為代表的大部分歐美人種，其RhD陰性個(gè)體均表現(xiàn)為RHD基因完全缺失。有學(xué)者對(duì)RhD陰性表型為的3名澳大利人進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)存在三種情況，其中1名完全缺失RHD基因，1名部分缺失RHD基因，另1名有著完整的RHD基因[4]。另有學(xué)者對(duì)非洲人種的Rh血型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其中部分非洲人中存在RHD假基因，包含RHD假基因的陰性個(gè)體會(huì)執(zhí)行對(duì)密碼子的抑制，從而致使RHD基無(wú)法完成轉(zhuǎn)變。此外還在部分非洲人種的RhD陰性中發(fā)現(xiàn)RHD-CE-D等位基因，這屬于雜交基因。據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，除了在非洲黑人種的RhD陰性中發(fā)現(xiàn)RHD-CE-D雜交位基因外，在對(duì)巴西RhD陰性個(gè)體進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，同樣在巴西RhD陰性個(gè)體中發(fā)現(xiàn)RHD假基因與RHD-CE-D雜交位基因，此外，還有部分巴西RhD陰性個(gè)體是RHD基因完全缺失的[5]。從以上國(guó)外研究報(bào)道可以發(fā)現(xiàn)，RhD陰性基因具有多態(tài)性特點(diǎn)，并因種族差異而呈現(xiàn)不同的遺傳背景。

通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，135例RhD陰性血液樣本經(jīng)Coombs試驗(yàn)確認(rèn)為RhD陰性表型個(gè)體中，顯示完全缺失D基因75例，占總數(shù)比例55.56%，顯示部分缺失D基因29例，占總數(shù)比例21.48%，顯示D基因完整31例，占總數(shù)比例22.96%，這與我國(guó)福建、廣東等地的RhD陰性血型研究報(bào)道結(jié)果相似。RHD基因完整中RhD(1227A)22例，占總數(shù)比例16.30%(22/135)，弱D15型1例，占總數(shù)比例0.74%(1/135)，RHD陽(yáng)性7例，占總數(shù)比例5.19%；檢測(cè)RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D8例，占總數(shù)比例5.93%(8/135)，DVa(Has)1例，占總數(shù)比例0.741%(1/135)，DVIⅢ1例，占總數(shù)比例0.74%(1/135)。有研究表明，我國(guó)人群中約有97%的RHD基因表現(xiàn)為RhD(1227A)突變，這有助于通過(guò)PCR-SSP法檢測(cè)RHD基的突變位置，所以PCR-SSP法基因分型將會(huì)成為今后檢測(cè)RhD(1227A)基因的重要手段。除了發(fā)現(xiàn)RhD(1227A)基因外，還發(fā)現(xiàn)了RHD陽(yáng)性、弱D15型、DVa(Has)、DVI、RHD-CE(2-9)-D8等多種形態(tài)的基因結(jié)構(gòu)。這與我國(guó)其他地區(qū)的有關(guān)報(bào)道較接近，說(shuō)明我國(guó)不同地區(qū)的人群有著相同的Rh血型遺背景。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中有12例血液樣本暫時(shí)不能確定RhD陰性的基因結(jié)構(gòu)，目前尚未明確具體原因，不過(guò)會(huì)在今后的工作中通過(guò)改善實(shí)驗(yàn)操作或更換試劑盒重新進(jìn)行檢測(cè)。

據(jù)有關(guān)研究報(bào)道，在對(duì)RhD陰性個(gè)體進(jìn)行檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)RhD基因，但這些RhD基因包含D基因卻不表現(xiàn)出D抗原特征[6]?，F(xiàn)推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因主要有兩個(gè)，其一是RhD陰性個(gè)體不是真正的RhD陰性，可能只是D抗原處于較弱勢(shì)態(tài)，由于受到乙醚放散試驗(yàn)的限制而未能檢測(cè)出其真實(shí)的基因結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)了7例RhD陰性個(gè)體顯示為RHD陽(yáng)性的基因；其二可能是RHD基因發(fā)生核苷酸片段變更、缺失或增加而出現(xiàn)突變現(xiàn)象[7]。我國(guó)RhD陰性人群的基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多態(tài)性特征，與歐美地區(qū)白種人的RhD陰性基因結(jié)構(gòu)有著明顯的區(qū)別，說(shuō)明用于檢測(cè)白種人RhD陰機(jī)制的基因定型試劑盒并不完全適用于中國(guó)人。若今后在采用PCR-SSP法基因分型檢測(cè)RhD陰性個(gè)體時(shí)出現(xiàn)不能確定的情況，則須通過(guò)確定RHD基因的排列順序來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)是否存在弱D型、部分D型結(jié)構(gòu)。RhD陰性血液發(fā)生輸血安全問(wèn)題的主要原因是抗D基因具有較強(qiáng)的免疫原性。當(dāng)RhD陰性血液接觸到Rh陽(yáng)性血液時(shí)，會(huì)有部分RhD陰性個(gè)體對(duì)D抗原發(fā)生致敏反應(yīng)，等到再次接觸到D抗原時(shí)就會(huì)出現(xiàn)溶血反應(yīng)。如果RhD陰性孕婦之前有過(guò)輸血史或生育史，在妊娠時(shí)容易出現(xiàn)新生兒溶血，是因?yàn)槟阁w是RhD陰性血，而胎兒是Rh陽(yáng)性血，兩者血型不匹配，Rh血型D抗原則會(huì)引發(fā)新生兒溶血癥。鑒于臨床輸血關(guān)系到受血者的生命安全，因此臨床醫(yī)學(xué)上應(yīng)對(duì)我國(guó)人群的RHD基因基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)進(jìn)行更加深入的研究，從而建立起適合我國(guó)人群的基因分型架構(gòu)。

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國(guó)家自然科學(xué)基金，(編號(hào)：81141056)

1006-6233(2017)02-0284-03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.033