陸維安

【摘 要】本文對(duì)在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行植物組織培養(yǎng)中的預(yù)防污染問題進(jìn)行了分析與闡述，重點(diǎn)介紹了植物組織培養(yǎng)過程中需要注意的有關(guān)操作問題，對(duì)相關(guān)的滅菌方法進(jìn)行了說明。

【關(guān)鍵詞】滅菌；組織培養(yǎng)；預(yù)防污染

植物組織培養(yǎng)是高中生物的重要課程之一，更是植物生理學(xué)的一種新興技術(shù)，該技術(shù)廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)與科研工作中，已形成自動(dòng)化、規(guī)?；?、控制化的培養(yǎng)模式。盡管在植物培養(yǎng)方面的有關(guān)理論和技術(shù)已比較完整，但在污染預(yù)防方面還需要更加深入的研究。

一、無菌操作與組織培養(yǎng)

在培養(yǎng)植物組織時(shí)，無菌培養(yǎng)與無菌操作是植物組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。一方面要避免自來生物入侵實(shí)驗(yàn)室，比如環(huán)境、衣服以及皮膚等方面的微生物污染。另一方面要避免微生物感染實(shí)驗(yàn)者。實(shí)驗(yàn)室要預(yù)防真菌與細(xì)菌孢子的入侵，需要做好實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的清潔工作。在實(shí)驗(yàn)前要認(rèn)真選擇外植體，并對(duì)外植體進(jìn)行滅菌處理。

二、外植體

在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，預(yù)防污染尤為重要，特別是在高溫多雨季節(jié)，由于這些季節(jié)空氣濕度大，微生物易滋生，無法采用一般的清毒措施對(duì)各種微生物進(jìn)行有效控制。因此需要對(duì)外植體進(jìn)行合適的選擇，比如健壯植株以及成熟的種子等，并嚴(yán)格進(jìn)行滅菌處理。

1.外植體的選擇

在選擇外植體時(shí)，實(shí)驗(yàn)者必須按照“易啟動(dòng)、污染少”的原則。植物體每一個(gè)部位都對(duì)培養(yǎng)工作的成功有著約定作用，比如莖段、莖尖的表皮與組織、塊莖的花藥、鱗莖、葉以及花瓣等。所選擇的外植體應(yīng)該是具有分生組織細(xì)胞并且不易污染的部分。同時(shí)，對(duì)外植體的應(yīng)用，需要在無菌條件下進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，事先沖洗枝條再插入自來水或營(yíng)養(yǎng)液中，形成外植體，這樣能夠有效避免出現(xiàn)額外的污染。也可以將已經(jīng)成熟的種子在完成消毒處理后制作成無菌苗，將芽苗的子葉、胚根以及胚軸作為材料，也能夠?qū)ξ廴酒鸬娇刂谱饔谩Ａ硗馔庵搀w的采集工作也應(yīng)在白天進(jìn)行，相比于清晨，采集的外植體污染更小，因?yàn)橥庵搀w在陽光的照射下，細(xì)菌量會(huì)大幅減少。因此，在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者需要選擇表達(dá)能力強(qiáng)并且不易污染的外植體，以提高培養(yǎng)成功的概率。

2.外植體滅菌

外植體滅菌包含深滅菌與表面滅菌兩種方法。葉片、莖段以及莖尖材料一般采用表面滅菌的方法進(jìn)行滅菌處理，可先利用自來水進(jìn)行沖洗，用軟毛刷將表面的污漬除掉，再利用氯酸鈉、氯化汞以等消毒劑進(jìn)行浸泡，對(duì)于部分莢果類植物，由于滅菌難度較大，可以用氯化汞溶液進(jìn)行滅菌處理。外植體的種類不同，滅菌的方法也存在著各自的差異，比如對(duì)于草莓莖尖組織，相關(guān)的滅菌方法涉及到5個(gè)不同的操作種類，比如次氯酸鈉滅菌、次氯酸鈣滅菌、過氧化氫滅菌、新潔爾滅滅菌等，其中比較適用于高中實(shí)驗(yàn)的滅菌方式為前4種，但此4種滅菌方法需要較長(zhǎng)的滅菌時(shí)間，但無論對(duì)實(shí)驗(yàn)者還是對(duì)接種材料來說都有著比較強(qiáng)的安全性保障。對(duì)于種子進(jìn)行消毒處理，則可以選擇比較傳統(tǒng)的滅菌方法，常規(guī)的滅菌方法即利用次氯酸鈉溶液對(duì)外植體進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)30分鐘的浸泡，必要時(shí)可選用升汞溶液進(jìn)行5分鐘的消毒處理。對(duì)于表面不光滑的材料，可以將少量表面活性劑溶于滅菌液中，以增大外植體與滅菌液之間的接觸面積，對(duì)消毒效果起到良好的改善作用。

3.不同滅菌劑之間的對(duì)比

酒精：使用濃度為70%～75%，操作容易，滅菌時(shí)間為0.1～3分鐘，滅菌效果較好；

氯化汞：使用濃度為0.1%～1%，操作較難，滅菌時(shí)間為2～10分鐘，滅菌效果最好；

漂白粉：使用濃度為飽和溶液，操作容易，滅菌時(shí)間為5～30分鐘，滅菌效果很好；

次氯酸鈣：使用濃度為9%～10%，操作容易，滅菌時(shí)間為5～30分鐘，滅菌效果很好；

次氯酸鈉：使用濃度為1%～5%，操作容易，滅菌時(shí)間為5～30分鐘，滅菌效果很好；

過氧化氫：使用濃度為10%～12%，操作最易，滅菌時(shí)間為3～5分鐘，滅菌效果較好。

三、組織培養(yǎng)中的各環(huán)節(jié)操作

組織培養(yǎng)中不規(guī)范的人工操作是出現(xiàn)污染的主要原因，需要通過人工手段對(duì)可能出現(xiàn)的各種污染進(jìn)行科學(xué)、有效的控制。產(chǎn)生污染的因素主要來源于培養(yǎng)工具與培養(yǎng)基，比如各種器皿、剪力以及鑷子等；超凈工作臺(tái)的各種過濾裝置在投入使用前沒有進(jìn)行充分的消毒處理；實(shí)驗(yàn)者自身沒有嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定來進(jìn)行操作。對(duì)污染進(jìn)行控制主要需要注意以下幾方面的問題。

1.培養(yǎng)器皿與培養(yǎng)基的滅菌

綜合運(yùn)用各種手段對(duì)種子材料、操作工具以及培養(yǎng)器皿進(jìn)行消毒處理。主要滅菌方法可以分為物理滅菌與化學(xué)滅菌兩種，物理滅菌主要包含紫外線照射、烘箱干熱以及高壓蒸汽等。化學(xué)滅菌主要包含次氯酸鈉、甲醛、漂白粉、新潔爾滅等滅菌方法。

2.特殊活性物質(zhì)與激素的滅菌

部分外植體無法采用高溫滅菌的方法進(jìn)行處理時(shí)，可以采用吲哚乙酸、赤霉素等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。對(duì)于部分通過乙醚進(jìn)行滅菌的干燥物質(zhì)操作處理，乙醚的去除需求在低溫環(huán)境下進(jìn)行，用無菌蒸餾水中進(jìn)行多次沖洗，最后將外植體置于培養(yǎng)基中。

四、結(jié)束語

預(yù)防污染是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。作為高中生在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中，要嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)規(guī)范，一定要做好消毒工作，在進(jìn)行操作前需要進(jìn)行如剪指甲以及洗手等方面的處理，提高操作安全性。