謝玲林

[摘要] 目的 探討SIRT6基因沉默對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法 構(gòu)建肝癌細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染SIRT6，檢測SIRT6 mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；將表達(dá)shSIRT6的慢病毒感染Huh-7細(xì)胞，培養(yǎng)后檢測SIRT6 mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平及凋亡情況。結(jié)果 成功構(gòu)建了沉默SIRT6基因的Huh-7穩(wěn)定細(xì)胞系，在Huh-7細(xì)胞中，mRNA表達(dá)的抑制率達(dá)81.25%，其SIRT6蛋白質(zhì)水平亦受到抑制；Huh-7細(xì)胞的凋亡比例為（16.52±2.08）%。 結(jié)論 SIRT6基因沉默可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制其增殖。

[關(guān)鍵詞] 肝細(xì)胞癌；SIRT6；增殖；凋亡

[中圖分類號] R735 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）01（c）-0054-03

Effect of SIRT6 Gene Silencing on the Proliferation and Apoptosis of Liver Cancer Cells

XIE Ling-lin

Microbiology Teaching and Research Room， Sichuan Nursing Vocational College， Chengdu， Sichuan Province， 610100 China

[Abstract] Objective To discuss the effect of SIRT6 gene silencing on the proliferation？and？apoptosis of liver cancer cells. Methods The SMMC-7721 was constructed and transfected with SIRT6， and SIRT6 mRNA and protein expression levels were tested， and SIRT6 mRNA， protein expression level and apoptosis were tested after culturing the slow-virus infection Huh-7 cells expressing shSIRT6. Results Huh-7 stable cell line of the silencing SIRT6 gene was successfully constructed， in the Huh-7 cells， the inhabitation rate of mRNA expression reached 81.25%， and the SIRT6 protein level was also inhabited， and the apoptosis ratio of Huh-7 cells reached （16.52±2.08）%. Conclusion SIRT6 gene silencing can induce the apoptosis of human hepatoma cells thus inhabiting the proliferation.

[Key words] Hepatocellular carcinoma； SIRT6； Proliferation；Apoptosis

肝細(xì)胞癌作為臨床上常見的惡性腫瘤，其患病率及病死率一直居高不下，手術(shù)是常用的治療手段，但效果常不盡如人意。探索肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制，尋求有效抑制癌細(xì)胞增生的新療法一直是臨床研究的重要課題。Sirtuins是存在于哺乳動物基因中的酵母沉默信息調(diào)節(jié)因子的同源基因，其中，沉默信息調(diào)節(jié)因子6（silent information regulator 6，SIRT6）具有抗癌作用，而當(dāng)SIRT6缺失時，細(xì)胞則會出現(xiàn)組蛋白H3第56位賴氨酸（histone H3 on lysine 56，H3K56）高度乙?；?，而這是與腫瘤息息相關(guān)的一類染色質(zhì)修飾。此外SIRT6對基因組的穩(wěn)定性、炎性反應(yīng)等都有調(diào)節(jié)作用，這也是其發(fā)揮抑癌作用的一個重要方面[1]。該研究以2015年1月—2016年1月來四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的88例肝癌患者的細(xì)胞系為研究對象，旨在探討SIRT6對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并分析其內(nèi)在機(jī)制，以期為肝癌的臨床治療提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

88例人肝癌細(xì)胞系SK-Hep-1、PLC/PRF/5、HepG2、Huh-7均來自2015年1月—2016年1月來四川護(hù)理職業(yè)學(xué)院附屬醫(yī)院就診的肝癌患者；永生化肝細(xì)胞系MIHA購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；pCMV6-XL5和pCMV6-XL5-XIAP質(zhì)粒購自Cell Biolabs公司；shSIRT6慢病毒購自GeneChem公司；SIRT6抗體購自Sigma公司；羊抗鼠IgG-HRP和GAPDH抗體購自上海市雅吉生物科技有限公司；羊抗兔IgG-HRP購自北京博爾西科技有限公司；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司；siRNA轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自上海聯(lián)碩生物科技有限公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南昌樂悠生物科技有限公司；培養(yǎng)基購自Gibco公司；RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在5%CO2，37℃的恒溫箱中分別對SK-Hep-1、PLC/PRF/5、HepG2、Huh-7 4個細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)，并按說明書進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及siRNA轉(zhuǎn)染。

1.3 Western blot

收集細(xì)胞，洗滌后加入裂解液，離心取上清液，電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用TBST洗膜，加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2hr，繼續(xù)洗膜，加入一抗，4℃放置12hr以上，棄一抗，TBST洗膜，二抗室溫2hr，TBST洗膜，加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。陰性對照以β-actin作為內(nèi)參，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

1.4 RT-PCR檢測

裂解細(xì)胞提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用試劑盒進(jìn)行RT-PCR，以β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

SK-Hep-1和Huh-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，洗滌并離心，加入195 μL Annexin-V結(jié)合液重懸細(xì)胞、6μL Annexin-V、4 μL PI，室溫避光孵育20 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，兩組間比較采用配對t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT6在肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)

經(jīng)RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，SIRT6在4個肝癌細(xì)胞系中的mRNA和蛋白質(zhì)水平較永生化肝細(xì)胞系MIHA明顯升高，見圖1、2。

2.2 慢病毒介導(dǎo)的shRNA對SIRT6的抑制作用

將表達(dá)shSIRT6的慢病毒感染Huh-7細(xì)胞，構(gòu)建SIRT6-shRNA-Huh-7穩(wěn)定細(xì)胞系，并采用RT-PCR和Western blot檢測SIRT6 mRNA及蛋白質(zhì)水平。結(jié)果表明，在Huh-7細(xì)胞中，mRNA表達(dá)的抑制率達(dá)81.25%；應(yīng)用Western blot檢測Huh-7細(xì)胞中SIRT6蛋白質(zhì)水平，結(jié)果顯示，其SIRT6蛋白質(zhì)水平亦受到抑制。

2.3 SIRT6基因沉默可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡

對感染慢病毒后的Huh-7細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示，Huh-7細(xì)胞的凋亡比例為（16.52±2.08）%，提示SIRT6基因沉默可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。

3 討論

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因在臨床中的應(yīng)用及潛在價值越來越受到醫(yī)務(wù)工作者的重視[2]。SIRT6是Sirtuin家族的重要成員，最早在酵母等低等生物中發(fā)現(xiàn)，隨后陸續(xù)在高等生物的基因中發(fā)現(xiàn)其同源序列。哺乳動物的Sirtuin家族包括7個成員，其中SIRT6在抗衰老及抗癌方面有著重要作用[3]。葡萄糖代謝在腫瘤細(xì)胞的生長、增殖中占據(jù)重要地位，SIRT6可通過調(diào)控胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來干預(yù)葡萄糖的代謝，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。除此之外，SIRT6還可參與基因的損傷修復(fù)，在維護(hù)正常基因序列的同時，對異變的腫瘤基因起到抑制、殺滅的作用[5]。

關(guān)于SIRT6在抗癌中的作用，既往有多位學(xué)者做了深入研究。該研究成功構(gòu)建了沉默SIRT6基因的Huh-7穩(wěn)定細(xì)胞系，在Huh-7細(xì)胞中，mRNA表達(dá)的抑制率達(dá)81.25%，其SIRT6蛋白質(zhì)水平亦受到抑制；Huh-7細(xì)胞的凋亡比例為（16.52±2.08）%。提示SIRT6基因沉默對于肝癌細(xì)胞的凋亡有促進(jìn)作用，這與既往相關(guān)學(xué)者的研究結(jié)果相一致。周洪鐘等[6]將表達(dá)shSIRT6-1、shSIRT6-2的慢病毒分別感染SK-Hep-1和Huh-7細(xì)胞，結(jié)果顯示，SK-Hep-1細(xì)胞中shSIRT6-1和shSIRT6-2組的細(xì)胞凋亡比例分別為（20.5±2.64）%和（18.4±2.1）%；Huh-7細(xì)胞中shSIRT6-1和shSIRT6-2組的細(xì)胞凋亡比例分別為（17.4±2）%和（21.93±2.45）%，提示SIRT6基因沉默可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞凋亡。SIRT6可通過p53、p73和ATM信號通路及影響ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。但亦有學(xué)者提出不同觀點(diǎn)，劉妙娜等[7]的研究證實(shí)，SIRT6在HepG2肝癌細(xì)胞株過度表達(dá)具有較為明顯的抗腫瘤作用，該作用在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上，抑制ERK1/2信號通路。同時，SIRT6過度表達(dá)能夠降低HepG2肝癌細(xì)胞ROS水平[8-9]。因而在關(guān)于SIRT6的具體抗癌機(jī)制及臨床應(yīng)用方面還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)語

SIRT6基因沉默在促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖方面效果顯著。但是，其具體的作用機(jī)制尚未研究透徹，操作手段目前發(fā)展尚不成熟，有待于進(jìn)一步深入研究。此外，關(guān)于SIRT6在腫瘤治療中的具體作用尚有爭議，其雙重作用可能有組織、因子分布乃至腫瘤分型及發(fā)展階段等息息相關(guān)，這些都需要科研人員及臨床工作者的進(jìn)一步探索。

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[6] 周洪鐘，陶娜娜，陳祥，等.SIRT6基因沉默對人肝癌細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報，2016，38（4）：389-396.

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