李文瑞，田樹軍,2，薛振衛(wèi)，劉艷敏，侯利軍，孫樹春,2*

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2．河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定071000；3．寧晉縣畜牧獸醫(yī)管理辦公室，河北邢臺 055550；4．廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北廊坊 065000）

奶牛定時輸精技術(shù)研究

李文瑞1，田樹軍1,2，薛振衛(wèi)3，劉艷敏4，侯利軍4，孫樹春1,2*

（1．河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北保定 071000；2．河北省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，河北保定071000；3．寧晉縣畜牧獸醫(yī)管理辦公室，河北邢臺 055550；4．廊坊市農(nóng)業(yè)局，河北廊坊 065000）

本試驗選擇產(chǎn)后25～35 d的健康荷斯坦牛，使用促黃體素釋放激素A3（LHRH-A3）和前列腺素（PGF2α）2種生殖激素，利用不同方案對參試牛進行定時輸精處理，研究奶牛定時輸精的技術(shù)效果及其影響因素。方案一為Ovsync程序處理（LHRH-A3+PGF2α+ LHRH-A3)，方案二為Ovsync程序改進方案（2次PGF2α處理）。結(jié)果表明：方案一與方案二的受胎率分別為21．21%和46．67%，方案二顯著高于方案一（P＜0．05）。方案二于最后一次注射藥物之后的18．1～19．0 h 和19．1～20．0 h進行定時輸精，其受胎率分別為44．44%和50．00%，二者之間差異不顯著（P＞0．05）；輸精時采用B超檢測卵泡直徑，發(fā)現(xiàn)卵泡直徑為≤14．7 mm、14．8～20．0 mm和20．1～25．2 mm時的受胎率分別為0．00%、75．00%和38．46%，卵泡直徑為14．8～20．0 mm組的受胎率顯著高于卵泡直徑≤14．7 mm組（P＜0．05）；不同季節(jié)開展定時輸精技術(shù)的受胎率，春季、夏季、秋季與冬季分別為30．21%、15．56%、40．00%和40．74%，秋季與冬季顯著高于夏季（P＜0．05）；高產(chǎn)奶牛與低產(chǎn)奶牛開展定時輸精技術(shù)，其受胎率分別為55．56%和33．33%，高產(chǎn)與低產(chǎn)組間無顯著差異（P＞0．05）。綜上可知，改進后的Ovsync程序比Ovsync程序效果好。

定時輸精；LHRH-A3；PGF2α；受胎率；奶牛

隨著奶牛養(yǎng)殖規(guī)模的快速擴大，奶牛的繁殖管理面臨著一些新的技術(shù)挑戰(zhàn)。現(xiàn)代奶牛養(yǎng)殖場由于牛舍內(nèi)部活動空間狹窄及水泥地面較硬，奶牛發(fā)情活動量減少50%～90%，因此觀察奶牛發(fā)情鑒定的工作越來越困難，發(fā)情奶牛的檢出率顯著降低；且養(yǎng)殖場奶牛數(shù)量增加導(dǎo)致配種員觀察每頭牛發(fā)情活動的時間也平均減少50%以上，因此在開展發(fā)情鑒定的日常工作過程中漏情現(xiàn)象頻發(fā)。另外，隨著產(chǎn)奶量的不斷提高，奶牛產(chǎn)后不發(fā)情、發(fā)情不明顯以及屢配不孕等繁殖疾病發(fā)生率升高，母牛產(chǎn)犢的胎間距拉長，這些問題嚴(yán)重?fù)p害了養(yǎng)殖場的經(jīng)濟效益。

針對上述奶牛繁殖疾病問題，目前通常使用誘發(fā)排卵來解決。牧場普遍使用Ovsync（OVS）程序作為發(fā)情排卵程序，但Ovsync程序僅適用于奶牛發(fā)情周期5～12 d，不能覆蓋發(fā)情周期的其他時間，且該程序使用后的妊娠率較低，同期效果差。通過對卵泡動力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，奶牛體內(nèi)黃體酮的分泌在發(fā)情周期的14 d內(nèi)不斷增長，黃體酮分泌水平?jīng)Q定排卵是否成功[1]。前列腺素（PGF2α）有溶解功能性黃體（排卵5 d后的黃體）[2]、興奮子宮[3]的功能，能夠降低奶牛體內(nèi)的黃體酮分泌水平。有研究表明，在奶牛產(chǎn)后30 d，每隔14 d注射PGF2α，待奶牛發(fā)情即配可提高奶牛發(fā)情率[4]。

本研究將Ovsync程序與間隔14 d注射2次PGF2α程序進行組合，即先對產(chǎn)后25～35 d的奶牛間隔14 d進行2次注射PGF2α，緊接著對奶牛進行Ovsync程序處理，目的是通過更加精準(zhǔn)地調(diào)控奶牛發(fā)情周期及排卵時間，探討在規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場實施奶牛定時輸精技術(shù)的可行性。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

1．1．1 實驗?zāi)膛?選擇產(chǎn)后25～35 d的健康荷斯坦牛為實驗牛。根據(jù)實驗開展時間，將一年劃分為春、夏、秋、冬4個季節(jié)：春分到夏至為春季；夏至到秋分為夏季；秋分到冬至為秋季；冬至到春分為冬季。根據(jù)實驗牛的產(chǎn)奶量，劃分為高產(chǎn)奶牛與低產(chǎn)奶牛。高產(chǎn)奶牛305 d產(chǎn)奶量在9 t以上，低產(chǎn)奶牛305 d產(chǎn)奶量為7～8 t。每種方案選擇30頭左右經(jīng)直腸檢測無繁殖疾病的任意胎次奶牛。

1．1．2 實驗藥品 注射用促黃體素釋放激素A3（LHRH-A3）和氯前列醇注射液（PGF2α），生產(chǎn)商分別為丹東市綠丹和華動物藥有限公司，生產(chǎn)批號分別為2013070和20150102?？梢晳言袡z測試劑盒生產(chǎn)商為北京艾德士元亨生物科技有限公司，規(guī)格為2×96孔，生產(chǎn)批號為201505。

1．1．3 儀器 HS-1600V便攜式獸用B超儀，為凸/線型超聲系統(tǒng)，制造商為Honda Electronivs Co．,Ltd。

1．2 實驗方法

1．2．1 奶牛定時輸精處理方案 對照組方案一：使用Ovsync程序，參試牛肌肉注射25 μg的LHRH-A3，記為第0天。第7天肌肉注射0．4 mg的PGF2α。于注射PGF2α后56 h，再次注射25 μg的LHRH-A3。于最后一次注射LHRH-A318～20 h，利用冷凍精液進行人工輸精。

試驗組方案二：使用Ovsync程序改進方案，參試牛肌肉注射0．4 mg的PGF2α，記為第0天。第14 d，肌肉再次注射0．4 mg的PGF2α。于第26天，執(zhí)行方案一的完整操作程序。

1．2．2 B超監(jiān)測卵泡發(fā)育 在奶牛進行輸精之前，用B超檢測雙側(cè)卵巢上的卵泡發(fā)育狀況，記錄卵泡的數(shù)量，并測量卵泡直徑。卵泡直徑為B超影像中卵泡相互垂直的長短徑，以長短徑的平均值作為卵泡的直徑。

1．2．3 定時輸精 于奶牛定時輸精處理方案中規(guī)定的輸精時間，采用直腸把握法進行輸精，精液注入部位為子宮體與子宮角的結(jié)合部。

1．2．4 早期妊娠診斷 于配種后第28天，采用IDEXX可視懷孕檢測試劑盒進行早期妊娠診斷。具體操作為靜脈采集奶牛血液7 mL于離心管中，靜置1 h分離血清，然后根據(jù)試劑盒說明書進行檢測。1．3 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS17．0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均使用四格表卡方，P＜0．05時差異顯著，P＜0．01時差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同處理方案對奶牛妊娠率的影響 由表1可以看出，方案一的奶牛妊娠率為21．21%，方案二的妊娠率為46．67%，兩者之間差異顯著（P＜0．05）。

表1 不同處理方案對奶牛妊娠率的影響

2．2 使用方案二后不同輸精時間間隔對妊娠率的影響 由表2可知，使用方案二，最后一次注射激素后與配種的時間間隔為18．1～19．0 h時，妊娠率為44．44%，間隔為19．1～20．0 h時妊娠率為50．00%，二者無顯著差異（P＞0．05）。

表2 不同輸精時間間隔對妊娠率的影響

2．3 方案二中卵泡直徑對受胎率的影響 由表3可知，卵泡直徑在14．8～20．0 mm時的妊娠率為75．00%，卵泡直徑為20．1～25．2 mm時的妊娠率為38．46%，二者之間無顯著差異（P＞0．05）。卵泡直徑≤14．7 mm時的受胎率為0．00%，與直徑為14．8～20．0 mm時的妊娠率之間差異顯著（P＜0．05），但卵泡直徑≤14．7 mm時的妊娠率與直徑在20．1～25．2 mm 時的妊娠率之間差異不顯著（P＞0．05）。

表3 卵泡直徑與妊娠率的關(guān)系

2．4 方案一中不同季節(jié)對妊娠率的影響 由表4可知，使用同期發(fā)情定時輸精技術(shù)，冬季妊娠率為40．74%，秋季妊娠率為40．00%，兩者差異不顯著（P＞0．05）；春季妊娠率為30．21%，與夏、秋、冬三季之間差異不顯著（P＞0．05）；而夏季妊娠率為15．56%，顯著低于秋、冬兩季（P＜0．05）。

2．5 方案二中產(chǎn)奶水平與受胎率的關(guān)系 由表5可得，經(jīng)過同期發(fā)情定時輸精技術(shù)后，高產(chǎn)奶牛的妊娠率為55．56%，低產(chǎn)奶牛的妊娠率為33．33%,二者之間差異不顯著（P＞0．05）。

表5 不同產(chǎn)奶量對妊娠率的影響

2．6 應(yīng)用定時輸精技術(shù)的效益分析 目前使用的發(fā)情程序較為復(fù)雜。如使用CIDR栓，此種方法需要將CIDR在陰道內(nèi)放置一段時間，而且里面有黃體酮釋放，奶牛需要每天擠奶，因此存在安全隱患，故不采??；另外，在實踐中人們較為普遍地使用Ovsync程序，此種商品每套為35元。而使用本實驗改進后的方法，總成本為33元，且受胎率極顯著高于其他程序。

使用同期排卵方案，生殖激素藥物成本33元，奶牛每天的飼養(yǎng)成本為60元，以一個1 000頭的奶牛場為例，正常的結(jié)構(gòu)下成母牛和適配牛700頭，在實驗時，實驗?zāi)膛鑫凑Ｊ褂脴?biāo)準(zhǔn)的同期發(fā)情程序，平均產(chǎn)孕間隔為139．4 d，以47．00%的成功率計算，奶牛場產(chǎn)孕間隔下降約為104．4 d，每頭產(chǎn)孕間隔減少35 d，每頭節(jié)省飼養(yǎng)費用2 100元，千頭牧場每胎節(jié)約成本為147萬元。

表4 不同季節(jié)對妊娠率的影響

3 討 論

3．1 處理方案對奶牛受胎率的影響 同期排卵定時輸精技術(shù)因使用便捷，操作簡單，易于生產(chǎn)分配，能夠治療繁殖疾病等優(yōu)點，在養(yǎng)牛業(yè)中使用越來越廣泛。然而同期排卵的方法也存在妊娠率低、同期效果不明顯等缺點。目前牧場使用較多的發(fā)情方案為Ovsync程序，研究發(fā)現(xiàn)，通過使用Ovsync方法對牛血漿中孕酮、蛋白、鈣、磷進行檢測，均處于正常范圍[5]。且有研究發(fā)現(xiàn)在注射PGF2α后56 h注射促性腺激素釋放激素（GnRH）效果最好[6]。雖然此法安全性高，牧場目前應(yīng)用較廣，但誘導(dǎo)發(fā)情率較低[7-9]。這是因為Ovsync適用的時間為發(fā)情期的5～12 d[10]，其他時間使用均無效。另外有研究發(fā)現(xiàn)，黃體組織雖然在發(fā)情周期的第7 d不再增大，但其分泌的黃體酮在發(fā)情周期的14 d內(nèi)不斷增加[11]。在CIDR栓使用之前2次PGF2α預(yù)處理的方法，同期效果顯著增強[12]。本研究在Ovsync前使用2次PGF2α預(yù)處理，2次PGF2α處理間隔14 d，無論奶牛處于發(fā)情周期的何時，通過2次注射激素，都能使黃體消除，達(dá)到發(fā)情周期的同步，在同步后的12 d，新的卵巢波發(fā)育的卵泡正處于使用Ovsync的最佳時間，此時使用效果最佳。另外在奶牛產(chǎn)后25～35 d使用PGF2α能夠收縮子宮，從而對奶牛子宮炎進行預(yù)防和治療，在配種時子宮處于良好狀態(tài)，有利于妊娠。本實驗通過對Ovsync程序優(yōu)化得出的結(jié)果：Ovsync程序的妊娠率為21．21%，經(jīng)過優(yōu)化后的處理方案妊娠率為46．67%，使用卡方檢驗二者之間差異顯著。

3．2 卵泡直徑與排卵時間對奶牛受胎率的影響 奶牛卵泡直徑與受胎率的關(guān)系主要表現(xiàn)在配種時卵泡是否發(fā)育成熟，若卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，并給予精子5～6 h[14]進行獲能，受胎率將大大提高。奶牛卵泡直徑在15 mm時一般是可以進行人工授精的，有報道指出卵泡大小在7～18 mm時受胎率較高，卵泡直徑在10～14 mm的受胎率顯著低于14．1～19．0 mm的受胎率。本研究得出卵泡直徑在14．8～20．0 mm時受胎率為75．00%,顯著高于直徑≤14．7 mm時的受胎率。奶牛的發(fā)情持續(xù)期為18～19 h，排卵時間為發(fā)情終止后的4～16 h。精子到達(dá)輸卵管壺腹部時間為2～13 min，保持受精時間為24～48 h[14]。本研究精確地記錄配種時間與奶牛妊娠率之間的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)發(fā)情配種時間在最后一次使用激素后18．1～19．0 h與19．1～20．0 h之間妊娠率無顯著差異。

3．3 繁殖季節(jié)對奶牛受胎率的影響 季節(jié)對奶牛繁殖力的影響，主要表現(xiàn)在夏季的熱應(yīng)激較嚴(yán)重。夏季牛血清中孕激素水平明顯上升，而皮質(zhì)醇、黃體生成素（LH）和雌二醇水平下降明顯，乳房炎和胎衣不下發(fā)病率隨著溫度的升高而增加，有研究表明夏季的受胎率較冬季降低13．1個百分點[15]。但在夏季人工授精前進行生殖激素注射可提高受胎率[16]。在炎熱夏季使用降溫配合生殖激素治療對低產(chǎn)奶牛發(fā)情效果明顯，妊娠率顯著提高[17]。本實驗中可以明顯看出夏季妊娠率（15．56%）顯著低于秋、冬兩季，但與春季之間差異不顯著。

3．4 產(chǎn)奶性能對奶牛受胎率的影響 在正常生理條件下奶牛隨著產(chǎn)奶量的增加，催乳素釋放量會迅速增加，而在奶牛上催乳素對垂體促性腺激素的釋放有抑制作用，一般在奶牛產(chǎn)奶高峰1個月后，產(chǎn)奶量與產(chǎn)后配種天數(shù)、產(chǎn)犢間隔成極顯著正相關(guān)，產(chǎn)奶量與受胎率呈極顯著負(fù)相關(guān)[18]。但使用同期排卵定時輸精的技術(shù)后，機體本身的激素調(diào)控被打破，使得激素能夠按照人的意愿上升或下降，因此可以減少產(chǎn)奶量對受胎率的影響。結(jié)果表明，高產(chǎn)奶牛與低產(chǎn)奶牛之間差異不顯著。綜上所述可知，經(jīng)過2次PGF2α預(yù)同步后，改進后Ovsync程序比Ovsync程序效果好。

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S823.91

A

10.19556/j.0258-7033.2017-03-063

2016-09-14；

2016-11-15

奶牛高效綜合養(yǎng)殖技術(shù)研發(fā)與示范(HBCT2013080 205)

李文瑞（1990-），女，河北大名人，在讀碩士，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail: 15933572802@163．com

*通訊作者：孫樹春(1961-)，男，內(nèi)蒙古海拉爾人，碩士，教授，研究方向為動物胚胎工程，E-mail：sun13731672361@126．com