程 雪，談瑄忠，蘇聯(lián)麟，陸兔林，毛春芹，張雪榮（.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 20023；2.南京市中醫(yī)院，南京 2000）

RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定桑杏口服液中蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷的含量Δ

程 雪1＊，談瑄忠1，2#，蘇聯(lián)麟1，陸兔林1，毛春芹1，張雪榮1（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 210023；2.南京市中醫(yī)院，南京 210001）

目的：建立同時(shí)測(cè)定桑杏口服液中蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷含量的方法。方法：采用反相高效液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為276、348 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為5 μL。結(jié)果：蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為1.068～10.68 μg/mL（r＝0.999 3）、9.320～93.20 μg/mL（r＝0.999 2）、46.91～469.1 μg/mL（r＝0.999 4）、0.511 0～5.110 μg/mL（r＝0.999 2）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜3%；加樣回收率分別為95.10%～101.90%（RSD＝2.1%，n＝9）、96.75%～101.80%（RSD＝1.4%，n＝9）、95.69%～100.00%（RSD＝1.5%，n＝9）、98.22%～104.60%（RSD＝2.1%，n＝9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于桑杏口服液中蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷含量的同時(shí)測(cè)定。

桑杏口服液；反相高效液相色譜法；蘆?。怀绕ぼ?；牛蒡苷；甘草苷

桑杏口服液由桑葉、牛蒡子、陳皮、甘草等組成，具有祛風(fēng)解（散）熱、宣肺豁（化）痰、止咳利咽的功效，臨床用于治療外感風(fēng)熱、肺衛(wèi)失宣之咳嗽。桑葉為方中君藥，具有滋陰補(bǔ)血、疏散風(fēng)熱之功效，藥理實(shí)驗(yàn)表明，桑葉中有效成分蘆丁具有降血糖、降血壓、抗菌和抗病毒等多種藥理活性[1-2]；牛蒡子為方中臣藥，長(zhǎng)于宣肺祛痰、清利咽喉，常用于風(fēng)熱感冒而見(jiàn)咽喉紅腫疼痛，有研究表明，牛蒡苷能明顯降低發(fā)熱模型家兔體溫，對(duì)二甲苯致炎模型小鼠和巴豆油致炎模型大鼠均有良好的抗炎作用[3-4]；陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰功效，為方中佐藥，橙皮苷是其質(zhì)控指標(biāo)成分[5-6]；甘草為方中使藥，具有清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和藥性之功效，藥理研究表明，甘草苷具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘及抗呼吸道病原體等作用[7-8]。目前，該口服液并沒(méi)有相關(guān)含量測(cè)定的內(nèi)容，因此完善該制劑的質(zhì)量控制十分必要。本試驗(yàn)采用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）同時(shí)測(cè)定上述4種有效成分，為桑杏口服液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型HPLC儀，包括VWD檢測(cè)器（美國(guó)Agilent公司）；Milli-Q Intergral水純化系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；MS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；LXJ-IIB型高速離心機(jī)（上海嘉鵬科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

桑杏口服液（南京市中醫(yī)院制劑室自制，批號(hào)：151102、151105、151107，規(guī)格：10 mL/瓶）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：100080-200707，純度：90.5%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201316，純度：≥98%）、牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)：110819-2011080，純度：≥98%）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201106，純度：93.7%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其余成分均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276、348 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液的制備

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution program

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 分別精密量取待測(cè)成分對(duì)照品適量，加甲醇制成蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷質(zhì)量濃度分別為1.068 0、0.932 0、0.938 1、1.022 0 mg/mL的單一對(duì)照品貯備液。分別量取上述單一對(duì)照品貯備液適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷質(zhì)量濃度分別為21.36、186.4、10.22、93.81 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品0.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容，以半徑為10 cm、3 000 r/min離心20 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按桑杏口服液處方和工藝制備缺桑葉、牛蒡子、陳皮、甘草的單一陰性樣品，并按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成單一陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷峰計(jì)分別＜5 000、5 000、1 500、2 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好；其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷回歸方程分別為y＝10.872x+0.265 8（r＝0.999 3）、y＝8.257 8x+1.459 2（r＝0.999 2）、y＝2.931 7x－6.304 1（r＝0.999 4）、y＝24.402x+1.525 2（r＝0.999 2）。結(jié)果表明，蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為 1.068～10.68、9.320～93.20、46.91～469.1、0.511 0～5.110 μg/mL。

2.5 精密度試驗(yàn)

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷峰面積的RSD分別為1.3%、1.0%、2.1%、2.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：151102）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、10、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷峰面積的RSD分別為1.6%、1.7%、1.9%、2.6%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批樣品（批號(hào)：151102）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷平均含量分別為0.095 54、0.912 6、4.011、0.042 67 mg/mL，RSD分別為1.2%、1.7%、2.1%、1.7%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量樣品（批號(hào)：151102）適量，共9份，每份0.2 mL，分別加入低、中、高質(zhì)量的待測(cè)成分對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測(cè)定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/支）Tab 3 Determination results of samples（n＝3，mg/per oral solution）

蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷、甘草苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為358、283、280、237nm[9]。本試驗(yàn)采用二極管陣列檢測(cè)器在200～400 nm處進(jìn)行掃描，選擇對(duì)蘆丁、甘草苷、橙皮苷、牛蒡苷均有較好響應(yīng)的348、276 nm波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 提取溶劑的選擇

筆者分別考察了甲醇、乙醇和水為提取溶劑，結(jié)果顯示，以水為提取溶劑時(shí)有效成分的提取率較低，且雜質(zhì)較多，以乙醇為提取溶劑時(shí)，有效成分的峰形及含量都不如甲醇，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)參考了2015年版《中國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn)[10-15]，比較了不同比例的乙腈-磷酸、乙腈-乙酸、甲醇-水的流動(dòng)相。結(jié)果顯示，乙腈-磷酸為流動(dòng)相時(shí)，可以較短時(shí)間測(cè)出蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷，且分離效果較好，峰面積較大。筆者還考察了不同磷酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)（0.05%、0.1%、0.2%）對(duì)有效成分峰形的影響。結(jié)果表明，0.1%磷酸溶液效果最好，故選擇乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相。

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，單一指標(biāo)成分的含量測(cè)定并不能有效地控制中藥復(fù)方質(zhì)量，本試驗(yàn)通過(guò)HPLC對(duì)方中藥材主要有效成分進(jìn)行測(cè)定，方法準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好，可用于桑杏口服液中蘆丁、橙皮苷、牛蒡苷和甘草苷含量的同時(shí)測(cè)定。

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Simultaneous Determination of Rutin，Hesperidin，Arctiin and Liquiritin in Sangxing Oral Liquid by RPHPLC

CHENG Xue1，TAN Xuanzhong1，2，SU Lianlin1，LU Tulin1，MAO Chunqin1，ZHANG Xuerong1（1.School of Pharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210023，China；2.Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210001，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of rutin，hesperidin，arctiin，liquiritin and glycyrrhizinate in Sangxing oral liquid.METHODS：RP-HPLC was performed on the column of Kromasil C18with mobile phase of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（gradient elution）at a flow rate of 1.0 mL/min，the detection wavelength was 276，348 nm，column temperature was 30℃，and the injection volume was 5 μL.RESULTS：The linear range was 1.068-10.68 μg/mL（r＝0.999 3）for rutin，9.320-93.20 μg/mL（r＝0.999 2）for hesperidin，46.91-469.1 μg/mL（r＝0.999 4）for arctiin，0.511 0-5.110 μg/ mL（r＝0.999 2）for liquiritin；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were less than 3%；recoveries were 95.10%-101.90%（RSD＝2.1%，n＝9），96.75%-101.80%（RSD＝1.4%，n＝9），95.69%-100.00%（RSD＝1.5%，n＝9），98.22%-104.60%（RSD＝2.1%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is accurate，sensitive and reproducible，and can be used for the simultaneous determination of rutin，hesperidin，arctiin and liquiritin in Sangxing oral liquid.

Sangxing oral liquid；RP-HPLC；Rutin；Hesperidin；Arctiin；Liquiritin

R927

A

1001-0408（2017）06-0812-04

2016-08-31

2016-10-27）

（編輯：張 靜）

國(guó)家臨床重點(diǎn)專科建設(shè)項(xiàng)目（No.蘇中醫(yī)綜〔2014〕3號(hào)）；南京市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（No.201605035）

＊碩士研究生。研究方向：中藥炮制與復(fù)方制劑。E-mail：878921875@qq.com

#通信作者：主任中藥師。研究方向：中藥學(xué)、藥事管理。電話：025-52276121。E-mail：txz282@sohu.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.06.25