楊 歡 王東軍 翁思穎 柴可夫

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

運脾和絡(luò)方對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)的保護及機制研究*

楊 歡 王東軍 翁思穎 柴可夫#

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310053

運脾和絡(luò)方 糖尿病周圍神經(jīng)病變 Caspase-3 氧化應(yīng)激 大鼠

糖尿病神經(jīng)病變(DPN)是糖尿病最為常見的并發(fā)癥之一，不僅縮短患者的預(yù)期壽命，增加其病殘發(fā)生率，而且給患者本人、家庭乃至社會帶來巨大的痛苦與沉重的負擔(dān)。目前除常規(guī)治療尚無特效藥物問世，而中醫(yī)藥對DPN的治療已積累了豐富經(jīng)驗，療效確切，而作用機制卻亟待闡明。本課題組前期研究表明，運脾和絡(luò)方(專利申請?zhí)?ZL200710156412.4)可上調(diào)糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘堿性蛋白、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，從而修復(fù)受損神經(jīng)[1]。此實驗研究旨在通過探討運脾和絡(luò)方對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)細胞Caspase-3表達、血清GSHPX、SOD活性及MDA含量的影響，探討其治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的可能機制?，F(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 材料

1.1 動物:清潔級健康雄性大鼠60只，體質(zhì)量200± 15g，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號:SCXK（滬）2013-0016，每籠4只，自由飲水，室溫22～26℃。濕度45%～65%，每日12h光照維持，晝夜循環(huán)，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)及管理。

1.2 藥品與試劑:運脾和絡(luò)方（黃芪30g，赤芍、蒼術(shù)各20g，金銀花、漢防己、當(dāng)歸各15g，玄參、威靈仙各12g）由浙江省中藥研究所制劑室提供:將全方藥材粉碎成粗粉，8倍水加減煎煮2次，每次1h，合并濾液，調(diào)整pH值至中性，濃縮定容至生藥含量1g/ml的溶液，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝后4℃保存?zhèn)溆?。甲鈷?0.5mg/片，北京星昊醫(yī)藥股份有限公司，生產(chǎn)批號:10150408；Caspase-3免疫組化試劑盒，兔來源多克隆抗體:美國Promega公司；GSH-PX、MDA El isa試劑盒:南京建成生物公司；SOD活性檢測試劑盒:NBT法，碧云天；ACCU-CH EK Advant age血糖儀:德國羅氏公司；血糖試劑條:德國羅氏公司，批號:451298；超薄切片機:德國萊卡EMUC；透射電鏡:日立H-7650牌。

2 方法

2.1 動物模型建立:SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量均在200g左右，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照完全隨機原則對其進行分組，正常組8只，造模組52只。造模組大鼠禁食不禁水12h，一次性腹腔注射1%STZ30mg/kg（STZ臨用前配制，溶于0.1mmo1/L、pH=4.5的無菌檸檬酸緩沖液，避光保存，30min內(nèi)使用），正常組腹腔注射等量的檸檬酸鈉緩沖液，造模組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，正常組予普通飼料喂養(yǎng)。72h后尾靜脈取血，測血糖≥16.7mmo1/L，即為造模成功。

2.2 分組與給藥:按條件選取造模成功大鼠40只，隨機分為模型組、運脾和絡(luò)方高、中、低劑量組、甲鈷胺陽性對照組，每組8只。運脾和絡(luò)方高、中、低劑量分別10g/kg/d、5g/kg/d、2.5g/kg/d，陽性組甲鈷胺用250mg/kg/d，模型組和正常組則灌服等量的蒸餾水，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃16周。

2.3 指標檢測:分述如下。

2.3.1 體質(zhì)量及血液指標測定:稱重后尾靜脈采血，測空腹血糖；給藥結(jié)束后取血，Elisa法測血清GSH-PX、SOD、MDA含量，運用公式計算GSH-PX、SOD活性。

2.3.2 免疫組化法檢測Caspase-3蛋白:采用WiVnt圖像分析系統(tǒng)在×200倍鏡下對Caspase-3陽性結(jié)果進行半定量分析。每個標本隨機觀察5個視野，以陽性產(chǎn)物面積/視野面積表示該抗原的相對含量，取其平均值。

2.3.3 電鏡觀察:取大鼠坐骨神經(jīng)(長約1mm)，置于預(yù)冷的5%戊二醛中固定，1%鋨酸進行后固定，然后漂洗，乙醇梯度脫水，丙酮包埋劑浸泡，修塊定位后切片，醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和液及檸檬酸鉛雙重染色，于透射電子顯微鏡下觀察糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示；計量資料多組間比較采用單因素方差分析；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體質(zhì)量及空腹血糖變化:見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖變化的比較（±s）

表1 各組大鼠體質(zhì)量、血糖變化的比較（±s）

注:與正常組比較，*P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與陽性組比較，▲P＜0.05。

組別正常組模型組陽性組低劑量組中劑量組高劑量組例數(shù)88888 8體質(zhì)量（g）治療前290.76±15.07 288.28±15.13*295.62±16.21 305.54±13.07 303.48±14.25 300.63±14.16治療后528.75±26.20 208.25±21.16*229.63±19.10＃213.38±20.22＃274.63±21.01＃415.25±20.19?！崭寡牵╩mol/L）治療前4.96±0.63 26.54±3.77*27.21±3.26 26.36±3.52 26.25±3.89 26.18±4.02治療后5.02±0.58 26.10±3.81*25.97±2.72 25.74±3.16 24.16±3.05 26.12±3.44

3.2 免疫組化及氧化應(yīng)激指標測定：見圖1。

圖1 各組免疫組化及氧化應(yīng)激指標比較

3.3 各組大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)影響:正常組:神經(jīng)膜細胞（SC）清晰可見，排列整齊，層次分明，電子密度比較一致。軸索（A）完整，線粒體結(jié)構(gòu)正常。模型組:髓鞘發(fā)生折疊起皺（↑），軸索膜與髓鞘板層分離（↑），軸索變小，失去與髓鞘的正常比例，線粒體腫脹變性，出現(xiàn)溶解破碎。陽性組:髓鞘較薄系再生表現(xiàn)（↑），部分髓鞘尚未完全長成。低劑量組:髓鞘斷裂（↑），部分髓鞘折疊起皺。中劑量組:髓鞘板層疏松呈不規(guī)則的膜樣團塊，軸索腫脹或萎縮（↑），并有空泡。高劑量組:軸索部分脫落（↑），神經(jīng)纖維和神經(jīng)膜細胞內(nèi)的線粒體腫脹。

4 討論

DPN是糖尿病主要的慢性并發(fā)癥，其發(fā)病機制目前尚未完全明了。Brownleen[2]提出的統(tǒng)一機制學(xué)說認為，經(jīng)典的糖尿病并發(fā)癥的多元醇途徑、糖基化終產(chǎn)物（AGES）途徑、蛋白激酶C（PKC）途徑和氨基己糖途徑均是高糖條件下線粒體呼吸鏈中氧自由基生成過多導(dǎo)致的結(jié)果。一方面，氧化應(yīng)激反應(yīng)可直接引發(fā)單鏈DNA的斷裂，或通過JNK、P38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)雪旺細胞中一系列半胱天冬酶激活，介導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生，其中Caspase-3在死亡受體和線粒體介導(dǎo)的經(jīng)典細胞凋亡途徑中均起著核心作用。另一方面，氧自由基可攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其最終產(chǎn)物為MDA。大量研究證實，超氧化物陰離子的過量產(chǎn)生導(dǎo)致的氧化應(yīng)激可損傷糖尿病動物的神經(jīng)和血管組織的DNA、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)速度下降，產(chǎn)生DPN。

中醫(yī)學(xué)中無DPN確切病名，《王旭高醫(yī)案》云:“消渴日久，但見手足麻木，制冷如冰?！卑Y狀描述和DPN相似［3］，可將其歸屬為“痹癥”“血痹”“痿證”等范疇。柴師有著多年的臨床實踐，認為DPN多見于久病不愈的患者，多由于消渴日久，氣血不足，脾運無力，痰瘀內(nèi)生，傷及絡(luò)脈所致，屬本虛標實證，認為若單從一方面論治很難達到治病求本、標本兼顧的效果。故在治療上培補脾氣以滋氣血生化之源，祛痰通絡(luò)以化瘀阻絡(luò)脈之標，運脾和絡(luò)方具有益氣化濕運脾、消痰化瘀和絡(luò)之效，標本雙顧對臨床治療有一定的指導(dǎo)意義。

從本實驗結(jié)果上看，運脾和絡(luò)方能夠抑制大鼠坐骨神經(jīng)Caspase-3的蛋白的表達，降低血清MDA含量，提高SOD、GSH-PX活性。通過電鏡超微結(jié)構(gòu)圖可以看出運脾和絡(luò)方對大鼠坐骨神經(jīng)具有一定的保護作用，可能與減輕糖尿病大鼠的氧化應(yīng)激，清除氧自由基、抗氧化，改善微循環(huán)，抑制軸索萎縮變性，減少神經(jīng)細胞凋亡有關(guān)，仍有待進一步研究證實。

[1]柴可夫,沈祥峰.運脾和絡(luò)顆粒對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)髓鞘堿性蛋白的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2013，28(7):1967-1970.

[2]Brownlee M.The pathobiology of diabetic compl ications a uni fying mechanism[J].Diabetes,2005,54(6): 1615-1625.

[3]龔騰芬，陳霞波.自擬益氣養(yǎng)血通絡(luò)方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變32例臨床觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2016，51(1):39-40.

2016-11-22

教育部科技發(fā)展中心2013年高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金聯(lián)合資助項目運脾和絡(luò)法調(diào)控線粒體分裂蛋白1（Drp-1)介導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細胞凋亡防治糖尿病周圍神經(jīng)病變，編號：20133322110002

# 通訊作者：柴可夫，E-mai l：ckf666@163.com