徐 靜 黃竹燕 葉夷露 劉丹丹 潘蓓蓓 俞月萍 張 琦#

1 溫州醫(yī)科大學 浙江 溫州 325035

2 杭州醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

3 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310009

黃連解毒湯提取物對原代神經元氧糖剝奪再灌注損傷后5-脂氧酶活性的影響*

徐 靜1，2黃竹燕3葉夷露2劉丹丹2潘蓓蓓3俞月萍2張 琦1，2#

1 溫州醫(yī)科大學 浙江 溫州 325035

2 杭州醫(yī)學院 浙江 杭州 310053

3 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院 浙江 杭州 310009

黃連解毒湯 原代神經元氧糖剝奪 再灌注損傷 5-脂氧酶 半胱氨酰白三烯 大鼠

腦缺血是嚴重危害人類健康的神經系統(tǒng)疾病。5-脂氧酶（5-LOX）是催化花生四烯酸生成白三烯（LTs）的關鍵酶。大量研究證實，5-LOX及其代謝產物半胱氨酰白三烯（CysLTs）介導腦缺血后炎癥反應，5-LOX抑制劑和CysLTs受體拮抗劑對腦缺血損傷具有保護作用[1-2]，表明5-LOX/CysLTs通路參與腦缺血再灌注損傷的病理生理過程。

黃連解毒湯（HJD）是清熱解毒的經典方劑。國內外研究表明HJD傳統(tǒng)水煎劑對體內、外腦缺血損傷均具有保護作用[3]。本研究采用大孔樹脂吸附法分離制備獲得50%乙醇提取物HJDEE50，觀察HJDEE50對大鼠原代皮質神經元糖氧剝奪（OGD）再灌注損傷的保護作用及對5-LOX活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF級新生SD大鼠（24h內）由上海斯萊克實驗動物有限公司提供[實驗動物合格證號:SCXK（滬）2012-0002]。

1.2 主要試劑與儀器:梔子苷、黃芩苷、鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀對照品購自中國藥品生物制品檢定所；漢黃芩素、漢黃芩苷和黃芩素對照品購自上海澤衡生物技術有限公司。連二亞硫酸鈉（Na2S2O4）和四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；兔抗多克隆5-LOX抗體購自Santa cruz公司；CysLTs酶聯免疫吸附試劑盒購自美國Cayman公司。高效液相色譜儀（Lumtech K501雙泵，德國），紫外可變波長檢測器（Lumtech K2501，德國），CO2培養(yǎng)箱（HF151，香港力康），酶標儀（Mul tiskan MK3，美國），流式細胞檢測儀（Beckman，美國）。

1.3 藥物制備和含量測定:黃連、黃芩、黃柏、梔子由華東醫(yī)藥股份有限公司提供并經鑒定，按3∶3∶2∶3的比例組方，蒸餾水浸泡2h，分別用水、50%乙醇、80%乙醇煎制，過濾后合并濾液，減壓濃縮至生藥含量為1.0g/ml的HJD浸膏。浸膏稀釋1倍后上D101型大孔樹脂柱，50%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮干燥得到HJDEE50。采用本實驗室建立的RP-HPLC法，測定HJDEE50中7個指標性成分的含量[4]。

1.4 原代皮質神經元培養(yǎng):新生24h內SD大鼠，分離剪碎大腦皮質，0.027%胰蛋白酶液37℃消化20min，含血清培養(yǎng)液終止消化，吹打后過200目篩網。離心后用種植液（DMEM-HG+10%FBS+10%HS）重懸，以1×106個/ml接種于96孔板內。24h后換維持培養(yǎng)液（NB+2%B-27+1% L-Glutamine），第3d加入5μg/ml阿糖胞苷。每隔2～3d換液，培養(yǎng)至7～9d后隨機分組實驗。

1.5 原代皮質神經元OGD模型制備和實驗分組:正常對照組用DMEM-HG孵育。OGD模型組神經元用無糖DMEMHG+10mmol/L Na2S2O4孵育20min后，換正常培養(yǎng)液再灌注 1h。齊留通組（10μmol/L）、HJD組（10mg/L）和HJDEE50組（1、10和100mg/L）分別于神經元OGD損傷前30min開始孵育，并維持至實驗結束。

1.6 細胞存活率檢測:棄去孔板中培養(yǎng)液，加入終濃度為0.5mg/ml的MTT溶液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后棄上液，每孔加入150μl DMSO振蕩10min。在490nm處測定吸光度（OD值），細胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（正常對照組OD值-空白組OD值）× 100%。篩選出HJDEE50作用的最佳劑量。

1.7 流式細胞檢測技術:細胞消化5min后，吹打細胞，收集細胞懸液，離心10min（1000rpm），棄上清，加0.5ml結合緩沖液重懸后，加入10μl PI與5μl Annexin VFITC，室溫下避光孵育5～10min，之后用流式細胞儀進行檢測。

1.8 免疫細胞化學法:準備好細胞爬片。采用兔抗5-LOX多克隆抗體（1∶50）和兔IgG-兩步法免疫組化試劑盒（即用型），按照說明書進行免疫細胞化學染色，DAB顯色，乙醇梯度脫水，中性樹脂和二甲苯（1∶1）封片。

1.9 酶聯免疫吸附法：各組參照1.5中的方法進行OGD建模。結束后，培養(yǎng)基中取細胞樣本200μl，離心后取上清備用。根據酶聯免疫反應試劑盒說明書步驟，測定CysLTs的含量。

1.10 統(tǒng)計學方法:數據用均數±標準差（-x±s）表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行分析，以單因素方差分析進行多組間差異的比較，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HJDEE50中指標性成分的含量:RP-HPLC結果顯示，在本色譜條件下7種標準品能達到較好分離。HJD主要含有7種指標性成分，含量分別為:梔子苷（1.46±0.02）%、黃芩苷（5.57±0.05）%、巴馬?。?.80±0.01）%、小檗堿（5.18± 0.04）%、漢黃芩苷（0.98±0.01）%、黃芩素（1.36±0.02）%、漢黃芩素（0.45±0.02）%，總含量為15.8%。HJDEE50主要含有4種指標性成分，其含量分別為:黃芩苷（23.99± 0.38）%、小檗堿（22.13±0.37）%、漢黃芩苷（5.19± 0.03）%、巴馬?。?.93±0.00）%，總含量為55.24%。

2.2 HJDEE50對原代神經元OGD再灌注損傷后存活率的影響:MTT法結果表明，OGD再灌注損傷使神經元存活率顯著降低。與模型組比較，HJDEE50（1、10、100mg/L）均可提高神經元存活率（P＜0.05或P＜0.01），有效劑量范圍較廣，最佳有效劑量為1mg/L，后續(xù)實驗將采用該劑量。與HJD（10mg/L）相比，HJDEE50（1mg/L）顯著提高神經元存活率（P＜0.01）。詳見表1。

表1 HJDEE50對神經元存活率的影響（±s）

表1 HJDEE50對神經元存活率的影響（±s）

注:與正常對照組比較，**P＜0.01；與OGD模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與HJD組比較，△△P＜0.01。

分組正常對照組OGD模型組HJD HJDEE50藥物濃度（mg/L）--1 011 0 100神經元存活率（%）100.00±0.00 64.80±5.53**72.41±2.51##80.73±5.00##△△75.29±8.50#73.11±2.06##

2.3 HJDEE50對神經元凋亡情況的影響:正常對照組活細胞數量約為95%；OGD模型組早期與中晚期凋亡細胞數量均顯著增加，活細胞數量顯著減少（P＜0.01）。與模型組比較，HJDEE50（1mg/L）組早期和中晚期凋亡細胞均顯著減少（P＜0.01）。與HJD相比，HJDEE50對細胞凋亡的抑制作用稍弱（P＜0.01）。詳見圖1。

圖1 HJDEE50對神經元凋亡的影響

2.4 HJDEE50對原代神經元OGD再灌注損傷后5-LOX分布的影響:正常對照組原代皮質神經元處于靜息狀態(tài)時，5-LOX均勻分布于細胞核、細胞質與突起上。OGD模型組約30%神經元中的5-LOX轉移到細胞核膜上，核染色加深，胞漿中有顆粒聚集。與模型組比較，HJDEE50組顯著抑制了5-LOX核膜轉移，使核膜轉移細胞數目下降約17%，胞漿中顆粒減少（P＜0.01）。但與HJD組相比，無顯著性差異（P＞0.05）。詳見圖2。

圖2 HJDEE50對5-LOX核膜轉移的影響

2.5 HJDEE50對原代神經元OGD再灌注損傷后CysLTs含量的影響:正常對照組CysLTs含量為423.1± 9.15pg/ml，OGD模型組CysLTs含量顯著增加，達531.7±21.71pg/ml（P＜0.01）。與模型組比較，齊留通組、HJD組和HJDEE50組均顯著減少，CysLTs含量分別降至455.7±22.31pg/ml、444.0±17.47pg/ml和464.2± 44.67pg/ml（P＜0.05或P＜0.01）。與HJD組比較，HJDEE50組CysLTs含量無顯著差異。詳見圖3。

圖3 HJDEE50對CysLTs含量的影響

3 討論

本研究發(fā)現，HJDEE50中指標性成分含量顯著高于HJD，可顯著提高OGD再灌注損傷后神經元存活率、抑制神經元凋亡。其作用機制可能與抑制神經元5-LOX核膜轉移、減少花生四烯酸代謝產物CysLTs含量，從而減輕炎癥反應相關。

5-LOX/CysLTs通路介導腦缺血損傷。Ciceri等[5]發(fā)現大鼠腦缺血后，大鼠腦內CysLTs顯著增加。通過檢查腦缺血死亡病人的腦組織，發(fā)現腦內5-LOX表達增加，并被激活[6]。靜息狀態(tài)時，5-LOX主要分布在細胞核、細胞質中，當被激活時5-LOX向核膜移位，代謝產物白三烯釋放增加。因此，5-LOX發(fā)生核膜轉移是其被激活的表現方式，并常作為藥物抗炎作用的靶點[7]。本研究結果發(fā)現，原代皮質神經元OGD再灌注損傷后，約30%神經元的5-LOX發(fā)生了核膜移位，CysLTs釋放增加，同時神經元活性下降，凋亡細胞增多。HJD和HJDEE50顯著抑制神經元5-LOX核膜移位和CysLTs釋放，增加神經元活性，減少神經元凋亡。上述結果提示，HJD和HJDEE50可能通過抑制5-LOX激活發(fā)揮抗神經元OGD損傷作用。

RP-HPLC結果顯示，HJD含有7種指標性成分，HJDEE50僅含有4種，缺少梔子苷、黃芩素和漢黃芩素，這可能與各成分在不同溶劑中的溶解度不同有關。但就指標性成分的含量而言，HJDEE50中4種成分總含量達到55.24%，顯著高于HJD中的7種成分的總含量，表明HJDEE50具有開發(fā)新藥的潛力。因此，研究HJDEE50對大鼠皮質神經元OGD再灌注損傷的作用，對于HJD經典方的二次開發(fā)工作具有重要意義。

研究發(fā)現，黃連解毒湯全方對缺血性腦損傷作用的強弱與方中主要指標性成分小檗堿、黃芩苷、梔子苷的含量相關[8]。HJD和HJDEE50抑制神經元OGD損傷后5-LOX激活可能與指標性成分的作用有關。已有研究表明，黃芩苷可抑制5-LOX核膜移位、減少炎癥產物CysLTs生成，發(fā)揮抗腦缺血作用[9-10]。然而，HJDEE50抑制5-LOX核膜移位的具體成分和作用機制尚不清楚，需要后續(xù)研究進一步證實。

總之，本研究結果表明HJDEE50對大鼠原代皮質神經元OGD再灌注損傷具有較好的保護作用，其機制可能與5-LOX/CysLTs通路有關。

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2016-11-18

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目黃連解毒湯活性部位對體內外神經細胞損傷的保護作用，編號：2012ZA025

# 通訊作者：張 琦，E-mail：zhangqiwzh@163.com