馬玉梅，張海霞，包曉婧，令瑛，李向茸，李瓊毅，魏嘉，李倬，馮若飛

(1．西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030; 2．生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州730030)

蝕斑法分離純化BHV-1和BPIV-3混合病毒

馬玉梅1，2，張海霞1，包曉婧1，2，令瑛1，2，李向茸2，李瓊毅2，魏嘉2，李倬2，馮若飛1，2

(1．西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730030; 2．生物工程與技術(shù)國家民委重點(diǎn)實驗室，甘肅蘭州730030)

利用蝕斑試驗方法對牛皰疹病毒1型(BHV-1)和牛副流感病毒3型(BPIV-3)的混合病毒進(jìn)行分離純化及鑒定，為BHV-1、BPIV-3感染的診斷提供科學(xué)依據(jù)。將不同稀釋度的BHV-1和BPIV-3混合病毒接種至牛腎原代細(xì)胞，加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，產(chǎn)生蝕斑后擴(kuò)增并RT-PCR鑒定。將純化后毒液分別進(jìn)行二次蝕斑純化及鑒定。結(jié)果BHV-1和BPIV-3混合病毒第6～7 d可產(chǎn)生明顯蝕斑。鑒定陽性的BHV-1和BPIV-3進(jìn)行二次蝕斑，鑒定結(jié)果均為陽性，且分離的兩種病毒TCID50測定結(jié)果為10－8．5/0.1 mL、10－6．5/0.1 mL。首次通過蝕斑試驗，成功分離并得到了兩株毒力較高且純化的BHV-1和BPIV-3病毒株。

牛皰疹病毒1型;牛副流感病毒3型;蝕斑試驗;病毒分離;病毒純化

牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus，BPIV-3)為單鏈負(fù)股有囊膜的RNA病毒，是引起牛和其他反芻動物急性呼吸道疾病的主要病毒之一，致使奶牛泌乳量的顯著下降，在一些牛場的急性感染病例可引起死亡，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。牛皰疹病毒1型(Bovine herpes virus，BHV-1)是有囊膜病毒，其基因組為雙股線性DNA。它是全球公認(rèn)的牛傳染性鼻氣管炎(IBR)的致病因子，能感染多種器官和組織。該病毒與中樞神經(jīng)紊亂有關(guān)［1-2］。以上兩種病毒混合感染在臨床成為牛呼吸道疾病綜合征的主要病原［3］。牛呼吸道疾病綜合征是一種急性呼吸道疾病。當(dāng)前，在世界范圍內(nèi)牛呼吸道疾病是危害牛健康和造成經(jīng)濟(jì)損失最嚴(yán)重的疾病之一［4］。本研究首次利用病毒蝕斑法試驗及RT-PCR試驗技術(shù)將BHV-1和BPIV-3進(jìn)行分離鑒定并純化，為牛皰疹病毒1型、牛副流感病毒3型感染的診斷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 BHV-1與BPIV-3混合病毒由本實驗室保存。牛腎原代細(xì)胞由甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供。試劑:胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司);病毒DNA/RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、Taq DNA聚合酶、PCR試劑，購自天根生化科技(北京)有限公司。

1．2 引物根據(jù)GenBank中公布的BHV-1基因(登錄號:KM258883.1)序列和BPIV-3基因(登錄號:NC_002161.1)序列，利用Primer Premier 5.0和Oligo6.0進(jìn)行引物設(shè)計，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 BHV-1和BPIV-3基因擴(kuò)增引物

1．3 BHV-1與BPIV-3混合毒液擴(kuò)增及TCID50測定本試驗所用的BHV-1和BPIV-3混合毒液在牛腎原代細(xì)胞上連續(xù)傳代3次，觀察到典型CPE后用于后續(xù)試驗。TCID50采用微量細(xì)胞病變法進(jìn)行滴定［5］。將混合病毒進(jìn)行10倍倍比稀釋，取10－1～10－10稀釋度接種于96孔板牛腎原代細(xì)胞中，每個梯度平行8孔，每孔100 μL，對照組加入100 μL DMEM，37℃、50 mL/L CO2吸附2 h，每孔加入100 μL含有3%胎牛血清的DMEM維持液，培養(yǎng)至第6天時記錄并判定結(jié)果，并按Reed-Munch法計算毒液TCID50/mL。

1．4 病毒蝕斑試驗將牛腎原代細(xì)胞接種于6孔板并長成致密單層。根據(jù)混合病毒TCID50，將毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋，選取10－3～10－6稀釋度的混合病毒液分別接種到6孔板中，37℃、50 mL/L CO2吸附2 h后，棄去病毒稀釋液，每孔加45℃保溫的營養(yǎng)瓊脂(含有5%胎牛血清和DMEM培養(yǎng)液，與等量的1%瓊脂糖混合)，待瓊脂凝固后，置37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72～96 h，觀察蝕斑生成情況。

1．5 蝕斑挑取、擴(kuò)增及鑒定挑取單個蝕斑，吹打混勻至96孔板牛腎原代細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至可觀察到CPE后，反復(fù)凍融3次，分別將各孔毒液接種于6孔板致密單層的牛腎原代細(xì)胞中，進(jìn)行病毒擴(kuò)增。擴(kuò)增后毒液分別用BHV-1與BPIV-3特異性引物進(jìn)行常規(guī)RT-PCR鑒定。鑒定為陽性的BHV-1、BPIV-3病毒液分別進(jìn)行二次蝕斑及驗證，方法同前。純化病毒分別進(jìn)行TCID50測定，方法同1.5所述。

2 結(jié)果

2.1 BHV-1、BPIV-3混合病毒細(xì)胞擴(kuò)增結(jié)果混合病毒感染牛腎原代細(xì)胞5 d后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE?；旌隙疽篢CID50為10－6．3/0.1 mL。

2．2 蝕斑試驗

2．2.1 蝕斑形成培養(yǎng)48 h的致密單層牛腎原代細(xì)胞6孔板，取10－3～10－6稀釋度的混合病毒液進(jìn)行接種，加營養(yǎng)瓊脂后培養(yǎng)，第7天在10－4稀釋度出現(xiàn)蝕斑(圖1)。蝕斑呈圓形或類圓形斑，大小不等，直徑為0.5～1.0 mm，邊緣清晰。鑒定陽性的病毒進(jìn)行第二次蝕斑，同樣條件下也出現(xiàn)同樣規(guī)律的蝕斑。

圖1 蝕斑法病毒分離純化結(jié)果

2．2．2 蝕斑純化后病毒鑒定第一次克隆時混合病毒挑取14個蝕斑進(jìn)行病毒擴(kuò)增，并分別進(jìn)行BHV-1與BPIV-3 RT-PCR鑒定，其中8個蝕斑BPIV-3為陽性，6個蝕斑BHV-1為陽性。每種選取2個陽性較強(qiáng)的克隆株，進(jìn)行二次純化并鑒定。結(jié)果顯示，二次純化后的BHV-1中不含BPIV-3，BPIV-3中不含BHV-1(圖2)。純化后BHV-1 TCID50為10－8．5/0.1mL。BPIV-3 TCID50為10－6．5/ 0.1 mL。

圖2 二次蝕斑純化后PCR驗證圖

3 討論

蝕斑試驗在許多研究中得到廣泛應(yīng)用［6、7］。由于新分離的病毒通常是許多在特性上不一致的病毒混雜群體，根據(jù)蝕斑的不同性狀，如蝕斑的形態(tài)、大小、產(chǎn)生斑的條件以及出斑的時間等進(jìn)行挑斑，便可對分離的病毒進(jìn)行純化。許多弱毒疫苗株就是通過蝕斑技術(shù)選育而成。本研究通過病毒蝕斑試驗分離并純化得到BHV-1和BPIV-3，對BHV-1和BPIV-3疫苗株的篩選和研究有著重要的意義。

［1］Abril C，Engel M，Liman A，et al．Both viral and host factors contribute to neurovirulence of bovine herpesviruses 1 and 5 in interferon receptor deficient mice［J］．Journal of virology，2004，78 (7):3644-3653．

［2］Roels S，Charlier G，Lettelier C，et al．Natural case of bovine herpesvirus 1 meningoencephalitis in an adult cow［J］．Veterinary Record，2000，146(20):586-588．

［3］Svensson C，Hultgren J，Oltenacu P A．Morbpdpty in 3-7-month-old dairy calves in south-western Sweden and risk factors for diarrhea and respiratory disease［J］．Prev Vet Med，2006，74:162-179．

［4］Keshaw T，Christine C，Brittany G，et al．Seroprevalence of Bovine Parainfluenza Virus Type 3(BPI-3V)in Ruminants from Grenada［J］．Open Journal of Veterinary Medicine，2016，6(2):23-27．

［5］張海霞，馮若飛，王丹，等．感染腦心肌炎病毒小鼠的腦組織病理損傷及體內(nèi)病毒分布情況［J］．中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43 (09):982-985．

［6］姜淑芳，張映梅，趙彤言，等．西尼羅病毒空斑形成試驗方法的建立與應(yīng)用［J］．中國媒介生物學(xué)及控制雜志，2006，17(2): 81-82．

［7］Turell M J，Guinn M，Oliver J．Potential for New York mosquitoes to transmit West Nile virus［J］．American Journal of Tropical Medicine＆Hygiene，2000，62(3):413-414．

Plaque Purification of BHV-1 and BPIV-3Mixed virus

MA Yu-mei1，2，ZHANG Hai-xia1，BAO Xiao-jing1，2，LING Ying1，2，LI Xiang-rong1，2，LI Qiong-yi2，WEI Jia2，LI Zhuo2，F(xiàn)ENG Ruo-fei1，2
(1．Life Science and Engineering College of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China; 2．Key Bio-engineering and Technology Laboratory of the Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)

In order to provide scientific basis for BHV-1，BPIV-3 diagnosis of infection，we utilized the plaque test for mixed virus isolation，identification and purification of bovine herpesvirus type 1(BHV-1)and bovine parainfluenza virus type 3(BPIV-3)，The various dilutions of BHV-1，and BPIV-3 mixed viruses were inoculated into a dense monolayer primary calf kidney cell，and the cells were then covered with nutritious agar．After generating plaques，the most obvious CPE clones were selected to be identified by RT-PCR reaction．Purification and identification of the purified venom were performed for two times．The plaques of BHV-1 and BPIV-3 mixed viruses were revealed after 6 to 7 days．Positive identification of BHV-1 and BPIV-3 was performed second plaque，and the results were still positive．The TCID50of the two virus isolates were 10－8．5/0.1mL and 10－6．5/0.1mL．For the first time，the two strains of BHV-1 and BPIV-3 with high virulence were successfully separated and purified by plaque assay．．

BHV-1;BPIV-3;Plaque assay;Viral isolation;Virus purification

FENG Ruo-fei

Q-33

A

0529-6005(2017)01-0037-03

2016-07-04

教育部“長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”項目(IRT13091);校企合作項目(蘭州民海生物工程有限公司，XBMU-2014-BC-18);中央專項研究生科研創(chuàng)新項目(Yxm2015210)

馬玉梅(1988-)，女(回族)，碩士生，研究方向為動物疫病病原學(xué)，E-mail:714397218@126．com

馮若飛，E-mail:fengruofei@xbmu．edu．cn