何 廈，徐 丹，2，盧 娟，董婉婷，胡澤文，汪 暉，2

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，湖北武漢 430071；2.發(fā)育源性疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430071）

孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對(duì)下丘腦
--垂體--腎上腺軸敏感性的影響及發(fā)生機(jī)制

何 廈1，徐 丹1，2，盧 娟1，董婉婷1，胡澤文1，汪 暉1，2

（1.武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，湖北武漢 430071；2.發(fā)育源性疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430071）

目的觀察孕期尼古丁暴露（PNE）所致子代大鼠高脂飲食下下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸應(yīng)激高敏感性改變，并探討其發(fā)生機(jī)制。方法受孕Wistar大鼠從孕9～20 d sc給予尼古丁2 mg·kg-1。自然出生仔鼠斷奶后給予高脂飲食喂養(yǎng)至20周（PW20），其中一半仔鼠從PW17至PW20給予3周不可預(yù)計(jì)性慢性刺激（UCS）。HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)改變，放免試劑盒和ELISA分別檢測(cè)大鼠血清促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）及皮質(zhì)酮（CORT）水平，PCR檢測(cè)ACTH釋放激素（CRH）、精氨酸加壓素（AVP）、囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2（VGluT2）、谷氨酸脫羧酶65（GAD65）、鹽皮質(zhì)激素受體（MR）、糖皮質(zhì)激素受體（GR）和谷氨酸脫羧酶67（GAD67）等相關(guān)基因的mRNA表達(dá)。結(jié)果正常對(duì)照組雌、雄仔大鼠經(jīng)UCS刺激后，血清ACTH和CORT分別升高了1.96倍（P＜0.01），1.63倍（P＜0.01）和3.24倍（P＜0.01），3.54倍（P＜0.01），PNE組雌、雄仔大鼠經(jīng)UCS刺激后，血清ACTH和CORT分別升高了3.96倍（P＜0.01），3.04倍（P＜0.01）和5.98倍（P＜0.01），5.22倍（P＜0.01）。與UCS處理的正常對(duì)照組仔大鼠相比，UCS處理的PNE組雌、雄仔大鼠下丘腦AVP mRNA表達(dá)分別升高了2.04倍（P＜0.01）和1.13倍（P＜0.05），雌性下丘腦CRH mRNA表達(dá)和VGluT2/GAD65 mRNA比值分別升高了2.49倍（P＜0.01）和1.14倍（P＜0.01）。全部PNE組雌、雄仔大鼠海馬各區(qū)均出現(xiàn)不同程度的病理?yè)p傷，表現(xiàn)為神經(jīng)元數(shù)量減少、排列稀疏和細(xì)胞間隙增大。與無(wú)UCS處理的正常對(duì)照組相比，無(wú)UCS處理的PNE雌、雄仔大鼠海馬MR/GR mRNA比值分別降低了88.0%和86.0%（P＜0.01），GAD67 mRNA表達(dá)分別升高了1.38倍和1.97倍（P＜0.05）；與UCS處理的正常對(duì)照組相比，UCS處理的PNE組雌性仔大鼠海馬GAD67 mRNA表達(dá)升高了2.17倍（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)NE可致高脂飲食成年子代大鼠HPA軸應(yīng)激高敏感性發(fā)生，其機(jī)制可能與海馬MR/GR比值失衡、GAD67表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而介導(dǎo)下丘腦局部潛在興奮性增加有關(guān)。

尼古丁；海馬；下丘腦-垂體-腎上腺軸；高敏感性

有關(guān)孕期尼古丁暴露（prenatal nicotine expo?sure，PNE）的危害已有許多相關(guān)研究，如宮外孕［1］、早產(chǎn)和宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）［2-3］，后期還可能導(dǎo)致出生后子代生長(zhǎng)發(fā)育不良［4］、學(xué)習(xí)記憶損傷［5］；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)PNE子代大鼠患糖尿病和肥胖病的概率增加［6-7］。下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pitu?itary-adrenal axis，HPA）是機(jī)體重要的神經(jīng)內(nèi)分泌軸。胚胎早期的不良宮內(nèi)環(huán)境會(huì)導(dǎo)致胎兒HPA軸發(fā)育異常，成年后表現(xiàn)為諸多神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)胎源性疾病易感［8］。我們的前期研究表明，PNE可導(dǎo)致IUGR子代HPA軸相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌代謝改變，成年后HPA軸出現(xiàn)高應(yīng)激敏感性現(xiàn)象［9］。然而PNE介導(dǎo)HPA軸高應(yīng)激敏感性的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。本研究采用PNE子代大鼠IUGR模型，出生后給予高脂飲食喂養(yǎng)并給予不可預(yù)計(jì)性慢性應(yīng)激（unpredict?able chronic stress，UCS），觀察子代大鼠HPA軸敏感性改變的現(xiàn)象，進(jìn)一步從海馬高位調(diào)節(jié)中樞調(diào)控失衡層面，探討HPA軸高敏感性的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物和試劑

尼古?。绹?guó)Sigma公司）；大鼠促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）放射免疫試劑〔北京生命科學(xué)技術(shù)研究所（中國(guó)北京）〕；大鼠皮質(zhì)酮（corticosterone，CORT）ELISA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)R&D生物科技有限公司）；Trizol（美國(guó)Invitrogen公司）；PrimeScript RT-PCR Kit（大連寶生物工程有限公司）；SYBR Select Master Mix（美國(guó)Applied Biosystems公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 動(dòng)物分組及樣本處理

未交配SPF級(jí)別健康Wistar大鼠（體質(zhì)量：雄性260～300 g，雌性180～220 g，（湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）提供，合格證號(hào)：2008-0005。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每晚18∶00以雌雄2∶1合籠，次晨觀察雌鼠陰栓或陰道涂片，以查到陰栓或精子時(shí)間作為受孕0 d（gestational day 0，GD0）。受孕大鼠隨機(jī)分為尼古丁組和正常對(duì)照組，每組9只。于GD9 sc給予尼古丁2 mg·kg-1至GD20，正常對(duì)照組給予等體積生理鹽水。孕鼠自然分娩后，選取仔鼠數(shù)量在8～14只的母鼠，取每只母鼠哺乳的雄、雌性仔鼠各2只，1/2仔鼠高脂飲食喂養(yǎng)至出生后20周（PW20）處死，另1/2仔鼠高脂飲食喂養(yǎng)至PW17尾部取血200 μL而后給予3周UCS（每天8∶00隨機(jī)給予一種刺激，包括禁食、禁水24 h、4℃冰水游泳、夾尾1 min、晝夜顛倒、50℃熱應(yīng)激5 min）。仔鼠于8∶00 am-10∶00 am斷頭取血并分離血清，迅速分離海馬、下丘腦等組織置于-80℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?，同時(shí)每組留取1～2個(gè)全腦組織用4%多聚甲醛溶液固定。

1.3 HE染色觀察海馬組織形態(tài)

成年仔鼠的固定腦組織經(jīng)石蠟包埋切片后進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察海馬形態(tài)改變。

1.4 血清ACTH及CORT濃度檢測(cè)

采用ACTH放免試劑盒和CORT ELISA試劑盒分別檢測(cè)大鼠血清中的ACTH和CORT含量。具體操作步驟見(jiàn)相應(yīng)說(shuō)明書(shū)。

1.5 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

用Trizol法提取大鼠海馬及下丘腦組織總RNA，并參照Prime Script RT-PCR試劑盒步驟合成cDNA，參照SYBR Premix Ex Taq試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)基因包括：磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehy?drogenase，GAPDH）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（ACTH releasing hormone，CRH）、精氨酸加壓素（arginine vasopressin，AVP）、囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白 2（vesicularglutamate transporter2，VGluT2）、谷氨酸脫羧酶65（glutamic acid decar?boxylase 65，GAD65）、GAD67、鹽皮質(zhì)激素受體（mineralocorticoid receptor，MR）和糖皮質(zhì)激素受體（glucocorticoid receptor，GR）。相關(guān)引物應(yīng)用軟件Primer Premier 5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，得到的特異性序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，經(jīng)PAGE純化。引物序列及PCR反應(yīng)條件見(jiàn)表1。采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法來(lái)獲得目的基因的相對(duì)定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS19和Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有的數(shù)據(jù)均以表示。兩組間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；同一組慢性刺激前、后的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Tab.1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對(duì)血清ACTH和CORT水平的影響

結(jié)果顯示，UCS處理前，PNE組雌、雄性仔大鼠血清ACTH和CORT水平均顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.01）；UCS刺激后，PNE組雌、雄仔大鼠血清ACTH水平顯著高于相應(yīng)的正常對(duì)照組（P＜0.01，P＜0.05），雌性仔大鼠血清CORT水平顯著高于相應(yīng)的正常對(duì)照組（P＜0.05）(表2)。UCS處理后，正常對(duì)照和PNE組雌、雄仔大鼠血清ACTH和CORT濃度均顯著升高（P＜0.01）。

2.2 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對(duì)下丘腦應(yīng)激活性及興奮/抑制性神經(jīng)元標(biāo)志基因表達(dá)的影響

表3結(jié)果顯示，給予UCS處理的PNE組雌性仔鼠下丘腦CRH mRNA表達(dá)及雌、雄性仔大鼠下丘腦AVP mRNA表達(dá)顯著高于給予UCS處理的正常對(duì)照組（P＜0.01）。無(wú)UCS處理情況下，與正常對(duì)照組比，PNE組雌性仔大鼠丘腦VGluT2 mRNA和GAD65 mRNA表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），雄性仔大鼠下丘腦VGluT2 mRNA顯著降低（P＜0.01），GAD65無(wú)明顯改變。給予UCS處理情況下，與正常對(duì)照組相比，PNE組雌、雄性仔大鼠下丘腦GAD65 mRNA表達(dá)均顯著高（P＜0.01，P＜0.05），VGluT2無(wú)明顯改變，雌性仔大鼠下丘腦VGLUT2/GAD65比值顯著升高（P＜0.01）。

2.3 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對(duì)海馬形態(tài)的影響

UCS處理和未處理的正常對(duì)照組仔大鼠海馬神經(jīng)元均排列緊密、細(xì)胞核染色均一；無(wú)UCS處理的PNE組雌性仔大鼠海馬錐體細(xì)胞層CA1、CA2、CA3區(qū)和UCS處理的PNE組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞核染色較淺；無(wú)UCS處理UCS的PNE組雄性仔大鼠海馬錐體細(xì)胞層CA3區(qū)和UCS處理的PNE組雄性仔大鼠海馬DG、CA1及CA3區(qū)細(xì)胞間隙增大，排列疏松（圖1）。

Tab.2 Effect of prenatal nicotine exposure（PNE）on serum ACTH and CORT level in female and male offspring rats under high fat diet

Tab.3 Effect of PNE on mRNA expression of CRH，AVP，VGluT2 and GAD65 in hypothalamus of female and male offspring rats under high fat diet

Fig.1 Effect of PNE on morphology of hippocampus in female（A）and male(B)offspring rats under high fat diet. See Tab.3 for rat treatment.DG：dentate gyrus.Arrows show the intercellular spaces dilation and nuclear staining lightness of hippocampal CAs and DG area.

2.4 孕期尼古丁暴露子代大鼠飼喂高脂飲食對(duì)海馬MR和GR mRNA表達(dá)的影響

表4結(jié)果顯示，無(wú)UCS處理的PNE組雌、雄性仔大鼠海馬基因MR mRNA表達(dá)較無(wú)UCS處理的正常對(duì)照組顯著降低（P＜0.01），GR和GAD67 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01，P＜0.05）。UCS處理的PNE組雌性仔大鼠海馬MR、GR及GAD67 mRNA表達(dá)較UCS處理的正常對(duì)照組均顯著升高（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）；雄性仔大鼠MR和GR mRNA也顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），GAD67無(wú)明顯改變。無(wú)UCS處理的PNE組雌、雄性仔大鼠海馬MR/GR表達(dá)比值顯著低于無(wú)UCS處理的正常對(duì)照組（P＜0.01）。

Tab.4 Effect of PNE on mRNA expression of MR，GR and GAD67 in hippocampus of female and male offspring rats under high fat diet

3 討論

我們的前期研究已證實(shí)，PNE出生后正常飲食的成年子代IUGR發(fā)生率增加，大鼠血清ACTH和CORT水平降低，HPA軸表現(xiàn)為低基礎(chǔ)活性［10］。許多研究指出，高脂飲食可促進(jìn)下丘腦室旁核CRH的合成和分泌，并增加慢性應(yīng)激后腎上腺CORT的釋放［11-12］。既往研究表明，PNE可能導(dǎo)致HPA軸功能異常，出生后高脂飲食會(huì)加重大腦損傷［13］，在受到慢性應(yīng)激后HPA軸功能異常更加明顯［14］。本研究結(jié)果顯示，UCS后，血清ACTH和CORT水平及各自增長(zhǎng)率均明顯升高，同時(shí)下丘腦CRH和AVP的表達(dá)也顯著升高，這進(jìn)一步證實(shí)PNE可引起正常和高脂飲食下成年子代HPA軸高應(yīng)激敏感性改變。

下丘腦PVN區(qū)域的下丘腦PVN區(qū)神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞（parvocellular neuroendocrine cells，PNC）通過(guò)接受來(lái)自中樞的興奮/抑制信號(hào)，以此增加/降低CRH和AVP的合成和分泌［15］。谷氨酸（glutamic acid，Glu）能和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能傳入信號(hào)的重塑是下丘腦PVN區(qū)興奮/抑制失衡的潛在機(jī)制。已知Glu和GABA是腦內(nèi)的兩個(gè)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，前者通過(guò)檸檬酸循環(huán)合成，由VGluT運(yùn)輸至突觸囊泡釋放后，與突觸后膜谷氨酸受體結(jié)合而發(fā)揮作用。GABA的合成關(guān)鍵酶為GAD其在腦內(nèi)有兩種同工酶GAD67和GAD65。GAD67以高飽和的全酶形式存在，與Glu有高的親和力，參與病理?xiàng)l件下GABA的合成和傳遞，而GAD65常以無(wú)活性的輔酶形式存在于神經(jīng)末梢的突觸囊泡膜上，參與生理?xiàng)l件下GABA的突觸傳遞［16］。VGluT2和GAD65在下丘腦組織中的分布分別與Glu能和GABA能神經(jīng)末梢高度一致，并分別參與了Glu的突觸傳遞和GABA的合成，被認(rèn)為是Glu能和GABA能神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物。在本研究中，UCS處理和未處理對(duì)PNE組仔大鼠下丘腦中VGLuT2基因的低表達(dá)無(wú)影響，但因給予UCS處理導(dǎo)致PNE組仔大鼠下丘腦中GAD65基因顯著升高，使得VGLuT2/GAD65比值顯著增高。由此PNE子代下丘腦存在局部的興奮性改變，這種改變可能是介導(dǎo)子代成年后HPA軸高應(yīng)激敏感性的主要原因。

海馬是HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的高位調(diào)節(jié)中樞，MR和GR分別參與基礎(chǔ)及應(yīng)激狀態(tài)下HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)［17］。MR和GR的活化可進(jìn)一步激活海馬相應(yīng)區(qū)域的GABA能神經(jīng)元，最終表現(xiàn)為對(duì)HPA軸的負(fù)反饋抑制信號(hào)。已有研究證實(shí)，海馬區(qū)MR/GR比值降低可使海馬在應(yīng)激狀態(tài)下對(duì)HPA軸的調(diào)節(jié)能力減弱，導(dǎo)致HPA軸高敏感性的發(fā)生［18］。本研究中，無(wú)UCS處理的PNE組雌、雄仔大鼠MR基因表達(dá)顯著降低，GAD67表達(dá)顯著升高，MR/GR比值顯著降低；有UCS處理的PNE組雌、雄仔大鼠MR基因表達(dá)顯著升高，雌性仔大鼠GAD67基因表達(dá)顯著升高，雄性無(wú)顯著差異。綜合形態(tài)學(xué)上的改變，我們推測(cè)在發(fā)育過(guò)程中由于PNE暴露損傷海馬發(fā)育，造成MR/GR比值失衡和海馬結(jié)構(gòu)、功能永久性病理改變，在此基礎(chǔ)上機(jī)體表現(xiàn)出GAD67表達(dá)上調(diào)的代償性改變，上調(diào)的GAD67表達(dá)可將海馬局部的興奮性遞質(zhì)Glu向抑制性遞質(zhì)GABA轉(zhuǎn)化，在UCS后表現(xiàn)為海馬對(duì)HPA軸負(fù)反饋減弱，進(jìn)一步導(dǎo)致HPA軸高應(yīng)激敏感性發(fā)生。

綜上所述，PNE子代大鼠出生后高脂飲食可致HPA軸應(yīng)激敏感性增加，其機(jī)制可能與海馬MR/ GR比值失衡、GAD67基因表達(dá)代償性上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致下丘腦局部潛在興奮性增強(qiáng)，最終表現(xiàn)為HPA軸的高應(yīng)激敏感性改變。

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Prenatal nicotine exposure induced high sensitivity of hypothalamic-pituitary-adrenal axis in offspring rats under high fat diet

HE Xia1,XU Dan1,2,LU Juan1,DONG Wan-ting1,HU Ze-wen1,WANG Hui1,2

(1.Department of Pharmacology,School of Basic Medical Sciences,Wuhan University, Wuhan 430071,China;2.Hubei Provincial Key Laboratory of Developmentally Originated Disease,Wuhan 430071,China)

OBJECTIVETo observe prenatal nicotine exposure(PNE)induced high sensitivity of hypo?thalamic-pituitary-adrenal(HPA)axis in offspring rats which were fed with a high-fat diet,and to explore the mechanism.METHODSNicotine(2 mg·kg-1per day)was injected subcutaneously to preg?nant Wistar rats from gestational day(GD)9 to GD20,and then the young rats were naturally delivered. After weaning,half of the offspring was fed with a high-fat diet until postnatal weeks(PW)20.The others were exposed to unpredictable chronic stress(UCS)from PW17 to PW20.The pathological changes in the hippocampus were analyzed by HE staining.The blood concentration of adrenocorticotropic hormone (ACTH)and corticosterone(CORT)was detected by RIA kits and ELISA kits,respectively.Meanwhile, real-time PCR was used to detect the mRNA expression of ACTH releasing hormone(CRH),arginine vasopressin(AVP),vesicular glutamate transporter 2(VGluT2),glutamic acid decarboxylase 65 (GAD65),mineralocorticoid receptor(MR),glucocorticoid receptor(GR)and glutamic acid decarboxylase 67(GAD67).RESULTSIn the normal control group,UCS treatment increased the level of serum ACTH and CORT 1.96 and 3.24 times in female rats,but 1.63 and 3.54 times in male rats.In the PNE group,UCS treatment increased the level of serum ACTH and CORT 3.96 and 5.98 times in female rats,but 3.04 and 5.22 times male rats.PNE increased the mRNA expression of AVP in the female and male rats 2.04 and 1.13 times in UCS treatment control group,and the mRNA expression of hypothalamus CRH and the ratio of VGLuT2/GAD65 were increased 2.49 and 1.14 times in female rats,respectively. Furthermore,the nicotine group exhibited histological changes to different degrees in the hippocampus and dentate gyrus area of the hippocampus.In the female and male nicotine groups,the mRNA ratio of hippocampal MR/GR decreased by 88.0%and 86.0%in comparison with the normal control group without UCS,and the mRNA expression of GAD67 was enhanced 1.38 and 1.97 times in female and male rats without UCS.In the female UCS treatment nicotine groups,the mRNA expression of GAD67 was increased 2.17 times compared with the UCS treatment control group.CONCLUSIONPNE can induce a high sensibility of HPA axis in offspring rats fed with a high-fat diet.The imbalance of hippo?campus MR/GR and the enhanced expression of GAD67 mRNA may be involved.

nicotine;hippocampus;hypothalamic-pituitary-adrenal axis;high sensibility

XU Dan,E-mail:xuyidan70188@whu.edu.cn，Tel:15972228956

R99

：A

：1000-3002-（2017）01-0080-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2017.01.010

2016-08-01 接受日期：2016-11-29）

（本文編輯：?jiǎn)毯纾?/p>

國(guó)家自然科學(xué)基金（81220108026）；國(guó)家科學(xué)自然基金（81371483）；國(guó)家科學(xué)自然基金（81430089）

何 廈，男，碩士研究生，從事外源發(fā)育毒性研究；徐 丹，女，副教授，博士生導(dǎo)師，從事外源物發(fā)育毒性研究。通訊作者：徐 丹， E-mail：xuyidan70188@whu.edu.cn，Tel：15972228956

Foundation item:The project supported National Natural Science Foundation of China(81220108026);National Natural Science Foundation of China(81371483);and National Natural Science Foundation of China(81430089)