郭 歡，崔彥農(nóng)，吳 凡，張 樂，許香玉，包愛科

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

植物生產(chǎn)層

鹽生植物四翅濱藜Actin基因片段的克隆及表達(dá)分析

郭 歡，崔彥農(nóng)，吳 凡，張 樂，許香玉，包愛科

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

在研究植物功能基因表達(dá)模式中肌動(dòng)蛋白(Actin)編碼基因是最常用的內(nèi)參基因之一。本研究根據(jù)藜科植物Actin基因編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物，以鹽生植物四翅濱藜(Atriplexcanescens)4周齡幼苗葉片的總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)方法擴(kuò)增出Actin基因片段并連接到pMD19-T載體上，所得陽性克隆經(jīng)PCR檢測(cè)后進(jìn)行測(cè)序。序列分析結(jié)果表明，該基因片段長(zhǎng)度為598 bp，編碼198個(gè)氨基酸；該序列與Genbank中登錄的高等植物Actin基因核苷酸序列同源性在84%以上，氨基酸序列同源性在94%以上。說明其為Actin基因片段，具有高度保守性，命名為AcACT。序列進(jìn)化分析顯示，AcACT與甜菜(Betavulgaris)和堿蓬(Suaedaglauca)肌動(dòng)蛋白編碼基因的親緣關(guān)系最近。熒光定量PCR分析結(jié)果表明，AcACT在鹽處理下各組織中的表達(dá)量恒定。表明AcACT可作為內(nèi)參基因來研究四翅濱藜耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)模式。

四翅濱藜；肌動(dòng)蛋白；基因克??；RT-PCR；氨基酸；甜菜；堿蓬

目前，全球干旱、半干旱區(qū)面積正在不斷擴(kuò)張，而土壤水分的長(zhǎng)期缺失會(huì)造成土壤鹽漬化程度日益加重，從而造成農(nóng)作物減產(chǎn)，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力下降。然而，日益惡劣的自然環(huán)境也孕育出豐富的抗逆植物種質(zhì)資源[1]。四翅濱藜(Atriplexcanescens)是藜科(Chenopodiaceae)濱藜屬的一類優(yōu)質(zhì)抗逆種質(zhì)資源，為多年生C4半常綠灌木，是一種典型的鹽囊泡類鹽生植物，原產(chǎn)自美國(guó)中西部地區(qū)，現(xiàn)廣泛分布于世界各地干旱半干旱地區(qū)[2-4]。由于其葉片表面密布的鹽囊泡具有反光作用，故又稱灰毛濱藜。四翅濱藜生命力頑強(qiáng)，對(duì)各種逆境環(huán)境(如高鹽、干旱、重金屬、極端溫度等)均表現(xiàn)出很強(qiáng)適應(yīng)性，是防風(fēng)固沙和鹽堿地改良的重要物種[5-7]。除此之外，由于四翅濱藜植株無明顯主干，樹冠團(tuán)狀，加之其種子再生性強(qiáng)，植株競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)潛力大，因此該物種可作為我國(guó)西北、華北、東北干旱半干旱及荒漠鹽堿地帶造林綠化、水土保持和牧場(chǎng)改良的優(yōu)良樹種；同時(shí)，其植株分枝繁多，枝葉茂盛，青綠期長(zhǎng)，體內(nèi)富含胡蘿卜素、粗蛋白等多種營(yíng)養(yǎng)成分，且適口性較強(qiáng)，可作為大部分牲畜的優(yōu)質(zhì)飼草[5,8]。綜上所述，四翅濱藜具有潛在的科學(xué)研究?jī)r(jià)值，并在我國(guó)北方生態(tài)環(huán)境恢復(fù)重建和畜牧業(yè)發(fā)展中具有巨大的應(yīng)用前景。然而，目前對(duì)四翅濱藜這一優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源的遺傳背景還不清楚，對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究也還相對(duì)薄弱。因此，需要對(duì)四翅濱藜獨(dú)特的抗逆機(jī)制及其分子基礎(chǔ)展開深入研究，而在研究其抗逆基因?qū)δ婢车捻憫?yīng)模式過程中，需要有看家基因作為內(nèi)標(biāo)參照。

肌動(dòng)蛋白(Actin)是細(xì)胞骨架的一個(gè)基本組分，42～45 kDa的細(xì)胞質(zhì)蛋白就能夠自行組裝成動(dòng)態(tài)絲狀結(jié)構(gòu)(微絲)，而在細(xì)胞內(nèi)被嚴(yán)格調(diào)控的肌動(dòng)蛋白微絲是真核生物發(fā)揮細(xì)胞功能的基本組分[9]。該蛋白以聚合體、絲狀體、單聚體或球狀體等形式存在于真核細(xì)胞中，并在各種生理生化過程中發(fā)揮重要作用，包括細(xì)胞分裂增殖，胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸分子軌道構(gòu)建，胞質(zhì)組織構(gòu)建，細(xì)胞質(zhì)流，極性運(yùn)動(dòng)，花粉管生長(zhǎng)[10]，病原體或結(jié)瘤[11]引起的細(xì)菌信號(hào)分子響應(yīng)變化等[12]。植物體內(nèi)Actin是由376或377個(gè)氨基酸殘基所組成，一般情況下，該蛋白會(huì)利用其分子表面與其它Actin結(jié)合蛋白發(fā)生作用，共同調(diào)控細(xì)胞內(nèi)多種生命進(jìn)程[13]。肌動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)與功能方面的研究屬于生物學(xué)的基礎(chǔ)性研究，隨著科技的不斷發(fā)展，對(duì)植物肌動(dòng)蛋白的研究還有待更深層次的研究，近年來的研究重點(diǎn)已經(jīng)轉(zhuǎn)移到了在其結(jié)合蛋白調(diào)控下的功能作用的研究方面[14]。

目前，已經(jīng)從許多植物中克隆到了Actin基因片段，如擬南芥(Arabidopsisthaliana，AY096397)、堿蓬(Suaedaglauca，EU429457)[15]、梭梭(Haloxylonammodendron)[16]、霸王(Zygophyllumxanthoxylum，EU019550)[17]、紅砂(Reaumuriasongarica)[18]、鹽生草(Halogetonglomeratus)[19]、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora)[20]、地黃(Rehmanniaglutinosa，EU526396)[21]等。肌動(dòng)蛋白普遍存在于真核細(xì)胞中，其氨基酸序列在各生物間的同源性高達(dá)70%～100%，是一種高度保守的古老蛋白，并且其基因是維護(hù)真核細(xì)胞基本功能的看家基因[22]；由于其表達(dá)水平受外界環(huán)境影響很小，并在各種組織中表達(dá)恒定，因此常作為分子內(nèi)標(biāo)來比較樣本來源不同的目的基因表達(dá)量差異[23]。

因此，本研究采用逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)技術(shù)，以鹽生植物四翅濱藜4周齡幼苗為研究材料，克隆其Actin基因片段，并利用熒光定量PCR驗(yàn)證鹽處理下該基因在不同組織中的表達(dá)量是否恒定。這將為深入研究四翅濱藜抗逆分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對(duì)其耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)模式提供內(nèi)標(biāo)參照，也可能對(duì)藜科植物抗逆功能基因的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所采用的四翅濱藜種子采自我國(guó)半干旱地帶寧夏地區(qū)。以4周齡幼苗為材料。RNAprep Pure Plant Kit購(gòu)自北京天根(Tiangen)，Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase購(gòu)自北京NEB，PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA合成試劑盒、pMD19-T載體及DNA Marker、PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?PremixExTaqTMⅡ熒光染料均購(gòu)自大連寶生物(Takara)，菌株大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金(TransGen Biotech)，Star Prep Gel Extraction Kit購(gòu)自GenStar(康潤(rùn))，其它常規(guī)和生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或進(jìn)口產(chǎn)品。樣品測(cè)序由蘇州金唯智公司(GENEWIZ)完成。

1.2 研究方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 將四翅濱藜種子經(jīng)物理方法(用粗砂紙將種子用力打磨，待種子上的翅被完全磨光之后過篩，選出大小基本一致的種子用于后續(xù)試驗(yàn))去翅之后，再經(jīng)70%(V/V)H2SO4處理，浸泡過夜(約14 h)以打破種子硬實(shí)，然后把種子沖洗干凈直接點(diǎn)種在鋪蛭石的培養(yǎng)皿中，上面再覆蓋一層薄蛭石，黑暗條件下催芽，保持蛭石表面濕潤(rùn)，3～5 d發(fā)芽后移栽到盛蛭石的穴盤中，用1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)4周。培養(yǎng)室晝溫為(25±2) ℃，夜溫為(23±2) ℃，光照時(shí)間為16 h·d-1，空氣相對(duì)濕度為70%左右，光照強(qiáng)度約為800 μmol·(m2·s)-1。

1.2.2 總RNA提取 首先剪取4周齡四翅濱藜幼苗嫩葉，用蒸餾水輕輕沖洗表面，然后用濾紙吸干表面水分并快速將其剪碎裝入1.5 mL RNase-free離心管中于液氮中速凍，再用研磨杵快速將組織磨至粉末狀，根據(jù)RNAprep Pure Plant Kit(Tiangen)操作說明提取其葉片總RNA。最后利用NANO-DROP1000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度及OD260/OD280值，濃度大于300 ng·μL-1并經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)其完整性后即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 按照PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA合成試劑盒(Takara)操作說明反轉(zhuǎn)錄得到cDNA第一鏈。然后利用DNAMAN 6.0軟件，根據(jù)已登錄到GenBank中的其它高等植物Actin基因核苷酸保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物用于PCR擴(kuò)增，引物序列分別為：上游，5′-GTGGTCGTACAACWGGTATTGTG-3′；下游，5′-GAHCCTCCAATCCAGACACTG-3′。

PCR反應(yīng)體系：在無菌潔凈的PCR管中建立50 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系，ddH2O 32.5 μL，10×GC Buffer(Mg2+Plus)10 μL，2.5 mmol·L-1dNTP Mixture 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 1 μL，Phusion?High-Fidelity DNA Polymerase 0.5 μL。

PCR反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。有目的條帶的切膠后按照StarPrep Gel Extraction Kit(GenStar)說明書進(jìn)行回收和純化。

1.2.4 陽性克隆的篩選與鑒定 按照pMD19-T載體(Takara)試劑盒操作說明，將回收產(chǎn)物連接到該載體上，然后轉(zhuǎn)化E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑法隨機(jī)挑取10個(gè)白色單菌落于盛400 μL LB+Amp液體培養(yǎng)基的1.5 mL滅菌離心管中，并挑取一個(gè)藍(lán)色菌落作為對(duì)照，180 r·min-1(37 ℃)搖菌2～3 h，待菌液渾濁后進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，同時(shí)再加400 μL LB+Amp液體培養(yǎng)基于原離心管中，繼續(xù)180 r·min-1(37 ℃)搖菌4～6 h至菌液渾濁。最后將擴(kuò)增出目的片段的優(yōu)勢(shì)條帶所在的菌液送去蘇州金唯智公司(GENEWIZ)測(cè)序。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 利用DNAMAN 6.0生物軟件進(jìn)行序列的比對(duì)和翻譯，并用MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列的BLAST比對(duì)。

1.2.6AcACT表達(dá)特性分析 利用熒光定量PCR分析四翅濱藜AcACT在鹽處理下各組織中的表達(dá)水平，具體實(shí)驗(yàn)方案如下：用含有100 mmol·min-1NaCl的1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液對(duì)4周齡四翅濱藜幼苗處理24 h，對(duì)照組正常澆灌1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液，取樣均分為根、莖、葉?？俁NA提取同1.2.2。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master Mix操作說明反轉(zhuǎn)錄合成熒光定量模板cDNA。同時(shí)根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列分別為：上游,5′-AAGAACTACGAGCTACCTGACGG-3′;下游,5′-GATACCAGAAGATTCCATTCCAAC-3′。然后根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ操作說明于八連管中建立20 μL反應(yīng)體系：ddH2O 5 μL，2×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，反轉(zhuǎn)錄cDNA稀釋10倍后的產(chǎn)物3 μL。用7 500 Real-Time PCR System系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0和WPS表格軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 四翅濱藜葉片總RNA的質(zhì)量

以4周齡四翅濱藜葉片為材料提取的總RNA，用NANO-DROP1000核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度為780 ng·μL-1，OD260/OD280值為1.96，再經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該RNA完整性良好，未發(fā)現(xiàn)降解，并觀察到28S r RNA和18S r RNA的條帶均清晰無拖尾，且兩者亮度比基本呈2∶1(圖1)。說明該RNA純度高，質(zhì)量好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，用設(shè)計(jì)好的一對(duì)特異性簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)在600 bp左右處有一清晰亮帶(圖2)，這基本符合目的片段的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度。因此該條帶很有可能是四翅濱藜AcACT基因片斷，但有待進(jìn)一步確定。

圖1 四翅濱藜總RNA凝膠電泳

圖2 AcACT基因RT-PCR產(chǎn)物凝膠電泳

注：M，2 000 bp DNA marker；1～3，Actin基因片段PCR產(chǎn)物。

Note: M, 2 000 bp DNA marker; 1～3, PCR products ofActingene fragment.

2.3 陽性克隆鑒定

將目的片段回收純化并連接轉(zhuǎn)化后，對(duì)隨機(jī)挑取的白色菌落搖菌并進(jìn)行PCR檢測(cè)，凝膠電泳觀察到這些擴(kuò)增片段長(zhǎng)度也在600 bp附近(圖3)，這一結(jié)果與RT-PCR結(jié)果一致，說明這些菌液呈陽性，可用于測(cè)序。

圖3 陽性克隆的PCR鑒定

注：M，2 000 bp DNA Marker；1～5，陽性克隆。

Note: M, 2 000 bp DNA Marker; 1～5, Positive clones.

2.4 測(cè)序結(jié)果與分析

將鑒定后的陽性克隆送去金唯智(GENEWIZ)測(cè)序，得到的AcACT基因片段長(zhǎng)度為598 bp，共編碼198個(gè)氨基酸(圖4)；運(yùn)用在線軟件Compute PI/MW預(yù)測(cè)其氨基酸序列等電點(diǎn)PI為4.94，分子量為21.86 kDa；并利用DNAMAN 6.0生物軟件將所測(cè)AcACT基因片段與隨機(jī)挑選的8種植物的Actin基因片段進(jìn)行氨基酸序列同源性比對(duì)(圖5)，比對(duì)結(jié)果顯示，該片段非保守氨基酸僅有23個(gè)，其余氨基酸均很保守，這表明AcACT基因片段高度保守。此外，Blast比對(duì)結(jié)果顯示，該Actin基因編碼的氨基酸與擬南芥(Arabidopsisthaliana，AY096397)、堿蓬(Suaedaglauca，EU429457)、霸王(Zygophyllumxanthoxylum，EU019550)、甜菜(Betavulgaris，KF214784)、鹽生草(Halogetonglomeratus，KF699314)、小花堿茅(Puccinelliatenuiflora， F J 545641)、地黃(Rehmanniaglutinosa，EU526396)、花生(Arachishypogaea，DQ873525)、水稻(Oryzasativa，AY212324)等GenBank中已登錄的其它高等植物的Actin基因編碼的氨基酸同源性均在84%以上。確定其為四翅濱藜肌動(dòng)蛋白基因片段，故將其命名為AcACT。這又進(jìn)一步說明肌動(dòng)蛋白是一種高度保守的蛋白。

圖4 AcACT基因片段的核苷酸序列及編碼的氨基酸序列

核苷酸序列的多重比較及系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，AcACT片段與甜菜BvACT(KF214784)和堿蓬SgACT(EU429457)的氨基酸同源性最高(96%)，表明AcACT片段與同科(藜科)植物的Actin基因片段親源關(guān)系很近，同時(shí)與不同科植物AtACT(AY096397)、OsACT(AY212324)、PoACT(KM349373)、HaACT(KM886609)、GhACT(AY305732)、HgACT(KF699314)等的氨基酸同源性也在93%以上(圖5、6)。

圖5 AcACT氨基酸序列與其它他植物氨基酸序列的同源性比對(duì)

注：各植物Actin基因簡(jiǎn)稱來源，堿蓬SgACT，陸地棉GhACT，馬齒莧PoACT，擬南芥AtACT，水稻OsACT，梭梭HaACT，甜菜BvACT，鹽生草HgACT。

Note: The sources ofActingene,SgACT(Suaedaglauca),GhACT(Gossypiumhirsutum),PoACT(Portulacaoleracea),AtACT(Arabidopsisthaliana),OsACT(Oryzasativa),HaACT(Haloxylonammodendron),BvACT(Betavulgaris),HgACT(Halogetonglomeratus).

圖6 AcACT與其他植物Actin基因氨基酸序列同源性分析

2.5AcACT基因的表達(dá)特性分析

利用熒光定量RT-PCR分析AcACT基因在鹽處理下各組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)對(duì)照和100 mmol·L-1NaCl處理24 h后，AcACT基因在四翅濱藜幼苗的根、莖、葉中均有表達(dá)，其中葉中表達(dá)量相對(duì)較根和莖中的稍微偏高，但總體表達(dá)量恒定；值得注意的是，鹽處理和對(duì)照相比表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)(圖7)。這說明AcACT基因具有表達(dá)穩(wěn)定性。

圖7 AcACT基因的表達(dá)特性分析

注：不同小寫字母表示同一器官對(duì)照與NaCl處理間差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters for the same plant organs indicate significant difference between CK and NaCl at the 0.05 level.

3 討論與結(jié)論

肌動(dòng)蛋白骨架結(jié)構(gòu)復(fù)雜、動(dòng)態(tài)多變，現(xiàn)在公認(rèn)其參與高等植物中諸多細(xì)胞活動(dòng)，顯著影響植物的形態(tài)建成和生長(zhǎng)發(fā)育[24]。肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)物可以通過控制細(xì)胞突出物的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特征來促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)[25]，從而發(fā)揮各種細(xì)胞功能。在高等動(dòng)植物中，Actin基因家族龐大，其不同成員的差異表達(dá)編碼不同肌動(dòng)蛋白，因而產(chǎn)生多種肌動(dòng)蛋白異型體，如擬南芥中至少有10種肌動(dòng)蛋白異型體[26]。而在細(xì)胞中不同的肌動(dòng)蛋白異型體基因被表達(dá)后都可發(fā)揮功能，其結(jié)構(gòu)上的多樣性反映出功能上的多樣性[27-28]，所以在多種生理生化過程中肌動(dòng)蛋白都發(fā)揮著重要作用。此外，植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中肌動(dòng)蛋白的動(dòng)力學(xué)變化是最為重要的一步反應(yīng)，植物胞質(zhì)中的肌動(dòng)蛋白響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)部或外界信號(hào)刺激，從而發(fā)生解聚或重組改變細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞接收到某些信號(hào)后會(huì)將其傳導(dǎo)給其它目標(biāo)，所有細(xì)胞即產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[29]，發(fā)揮其功能。然而，肌動(dòng)蛋白基因不僅在植物細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，同時(shí)該蛋白基因核苷酸和氨基酸序列在進(jìn)化上均具有較高的保守性和同源性，因而其作為看家基因發(fā)揮著無可替代的作用[30-31]。此外，四翅濱藜作為我國(guó)西北地區(qū)的優(yōu)勢(shì)種，特性優(yōu)良，應(yīng)用潛力巨大，但目前對(duì)其獨(dú)特的抗逆分子機(jī)制還知之甚少。綜上所述，要深入研究一個(gè)遺傳信息和分子生物學(xué)背景不清楚的物種，首先要探究其體內(nèi)某些功能基因的功能及表達(dá)特性，這就有必要對(duì)該物種的肌動(dòng)蛋白基因進(jìn)行克隆并分析其序列，同時(shí)還需要驗(yàn)證該基因的表達(dá)穩(wěn)定性，以證實(shí)其可作為理想的內(nèi)標(biāo)參照。

本研究克隆到的AcACT基因片段長(zhǎng)度為598 bp，滿足實(shí)時(shí)定量及半定量分析基因表達(dá)量時(shí)引物設(shè)計(jì)的需要，其核苷酸序列與已登錄在Genbank中的其它植物Actin基因核苷酸序列的同源性在84%以上，所編碼的氨基酸序列同源性在94%以上。同時(shí)，熒光定量PCR分析結(jié)果也表明AcACT基因在鹽處理下不同組織中的表達(dá)量恒定，可作為理想的內(nèi)參基因。因此，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了前人的結(jié)論，表明Actin基因是一種高度保守的看家基因。此外，四翅濱藜這一物種廣泛分布于干旱半干旱荒漠鹽堿地帶，在其體內(nèi)蘊(yùn)藏著豐富的抗逆基因資源，深入挖掘這些資源將對(duì)于運(yùn)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來改良牧草抗逆性具有極其重要的意義。本研究克隆到AcACT片段進(jìn)一步豐富了肌動(dòng)蛋白基因的資料庫(kù)，這為以AcACT基因作為內(nèi)參基因來研究四翅濱藜其他功能基因的調(diào)控機(jī)制及表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 王芳)

Cloning and expression analysis of anActingene fragment from the halophyteAtriplexcanescens

Guo Huan, Cui Yan-nong, Wu Fan, Zhang Le, Xu Xiang-yu, Bao Ai-ke

(State Key Laboratory of Grassland Agro-ecosystems, College of Pastoral Agricultural Science and Technology, Lanzhou University, Lanzhou 730020, China)

TheActingene is one of the most commonly used reference genes for studying functional gene expression patterns. In this study, total RNA was extracted from the leaves of 4-week-oldAtriplexcanescensseedlings, and anActingene fragment was obtained by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and linked into pMD19-T vector using primers designed based on conservedActingene sequences from similar plant species. The positive clones identified by PCR were sequenced, and the results showed that theActingene fragment ofA.canescenscontains 598 bp encoding 198 amino acids. Homology comparison withActingenes from other higher plants in GenBank indicate that this gene fragment shared more than 84% nucleotide sequence similarity and 94% amino acids sequence homology with other plants, suggesting strong conservation of this gene. Our results confirmed that the cloned gene was anActingene fragment, which we named asAcACT. Phylogenetic analysis showed a close relationship betweenAcACTand theActingenes fromBetavulgarisandSuaedaglauca. Meanwhile,AcACTexpression was constant in different tissues under salt treatment based on quantitative PCR analysis, which suggests thatAcACTcan be used as a reference gene for studying the expression patterns of salt tolerance-related genes ofA.canescens.

Atriplexcanescens; Actin; gene cloning; RT-PCR; amino acids;Betavulgaris;Suaedaglauca

Bao Ai-ke E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0157

2016-03-25 接受日期：2016-06-17

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372360)；“本科教學(xué)工程”國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201610730105)；“中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金”自由探索項(xiàng)目(lzujbky-2015-250)

郭歡(1992-)，女，甘肅靖遠(yuǎn)人，在讀碩士生，主要從事植物逆境生理與分子生物學(xué)。E-mail:guoh2014@lzu.edu.cn

包愛科(1980-)，男，甘肅岷縣人，副教授，博士，主要從事草類逆境生理與基因工程研究。E-mail:baoaik@lzu.edu.cn

Q943.2

A

1001-0629(2017)3-0515-08*

郭歡，崔彥農(nóng)，吳凡，張樂，許香玉，包愛科.鹽生植物四翅濱藜Actin基因片段的克隆及表達(dá)分析.草業(yè)科學(xué),2017,34(3)：515-522.

Guo H,Cui Y N,Wu F,Zhang L,Xu X Y,Bao A K.Cloning and expression analysis of anActingene fragment from the halophyteAtriplexcanescens.Pratacultural Science，2017,34(3)：515-522.