肖衎+杜合軍+趙珣+劉雪清+劉娟娟

摘要：利用特異性引物MHCⅠf和MHCⅠr，分別從30尾野生中華鱘（Acipenser sinensis）、30尾中華鱘子一代和30尾中華鱘子二代的基因組DNA中擴(kuò)增MHCⅠa基因的多肽結(jié)合位點(diǎn)（PBR）片段，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為127 bp。中華鱘野生群體30個(gè)樣品265個(gè)有效克隆中共檢測(cè)出50條特異序列（單倍型），中華鱘子一代群體30個(gè)樣品的278個(gè)有效克隆中共檢測(cè)出66條特異序列（單倍型），中華鱘子二代群體30個(gè)樣品的257個(gè)克隆中檢測(cè)出64條特異序列（單倍型）。單倍型Acsi-UAB*0101在3個(gè)群體中所占的百分比最高，分別為58.1%、38.8%和60.7%。單倍型分布及群體內(nèi)遺傳多樣性參數(shù)分析表明，中華鱘子一代群體的MHC基因遺傳多樣性最豐富，野生中華鱘群體的MHCⅠa基因遺傳多樣性較低。中華鱘野生群體非同義替代與同義替代比率為1.33，分析表明正向選擇可能是中華鱘MHCⅠa多態(tài)性的主要因素。該研究結(jié)果提供了中華鱘從野生群體到子二代群體MHCⅠa基因的部分遺傳信息和遺傳變異規(guī)律，為中華鱘全人工種群優(yōu)化和繁殖管理提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：中華鱘（Acipenser sinensis）；主要組織相容性復(fù)合體（MHC）；遺傳多樣性；遺傳管理

中圖分類(lèi)號(hào)：S965.215；Q75 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）02-0306-08

中華鱘（Acipenser sinensis）是中國(guó)特有的古老大型海河洄游性魚(yú)類(lèi)，目前已處于極度瀕危狀態(tài)。建立人工遷地種群是避免該物種在近期滅絕的一種方式，而人工群體往往面臨家養(yǎng)化問(wèn)題。主要組織相容性復(fù)合體（Major Histocompatibility Complex，MHC）是脊椎動(dòng)物中與病原識(shí)別及防御、親緣識(shí)別和婚配等適應(yīng)性遺傳密切相關(guān)的基因。MHC基因包括兩個(gè)典型的亞類(lèi)和非典型的基因類(lèi)，即典型的Ⅰ類(lèi)基因、Ⅱ 類(lèi)基因和補(bǔ)體類(lèi)細(xì)胞因子等Ⅲ類(lèi)基因，Ⅰ類(lèi)基因與識(shí)別和遞承內(nèi)源性抗原相關(guān)，主要識(shí)別病毒類(lèi)抗原。MHC基因已成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)基因，廣泛用于疾病相關(guān)性、分子生態(tài)和進(jìn)化、保護(hù)遺傳、繁殖行為等研究領(lǐng)域[1-7]。

MHC Ⅰ類(lèi)與MHC Ⅱ類(lèi)基因家族中抗原結(jié)合區(qū)域（Peptide binding region，PBR）是其變異最高的區(qū)域。在種群遺傳多樣性研究中，通常采用檢測(cè)PBR水平來(lái)評(píng)價(jià)群體的MHC遺傳多態(tài)性水平。近年來(lái)，MHC基因多態(tài)性與魚(yú)類(lèi)抗病相關(guān)性也已有較多報(bào)道。截至目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于MHC基因多態(tài)性和不同的等位基因與魚(yú)類(lèi)的抗病力相關(guān)性研究主要集中在牙鲆[8-11]。Jia等[12]對(duì)德國(guó)鏡鯉MHC Ⅰ、Ⅱ基因多態(tài)性也進(jìn)行了研究。李雪松等[13]和趙雪錦等[14]對(duì)“全紅”和“粉玉”體色甌江彩鯉MHC基因多態(tài)性與抗病性的關(guān)系進(jìn)行了初步研究。國(guó)外對(duì)此方面的研究則主要集中在少數(shù)幾種鮭科魚(yú)類(lèi)：如虹鱒、大西洋鮭[15-20]。對(duì)于鱘形目魚(yú)類(lèi)，目前僅一篇報(bào)道有關(guān)中華鱘和匙吻鱘的MHC Ⅰ基因進(jìn)化研究[21]，在GenBank中有大西洋鱘（Acipenser oxyrinchus）和歐洲大西洋鱘（Acipenser sturio）的兩條MHC Ⅱ基因序列（GenBank序列號(hào)分別為AJ515709.1、AJ515708.1）以及西伯利亞鱘（Acipenser baerii）MHC Ⅱ 3條基因序列（JO288773.1、JO288774.1、JO288775.1），對(duì)中華鱘MHC基因遺傳多樣性相關(guān)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬在MHC Ⅰa PBR座位上對(duì)野生中華鱘及蓄養(yǎng)在中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所人工繁殖的中華鱘子一代種群和子二代種群為研究對(duì)象，通過(guò)分離和篩選中華鱘MHC Ⅰa基因座位，對(duì)野生群體及人工繁殖的中華鱘子一代和子二代3個(gè)不同種群的MHC Ⅰa遺傳變異水平和遺傳結(jié)構(gòu)及野生種群與人工繁殖種群的遺傳變異差異進(jìn)行了分析，為中華鱘全人工種群優(yōu)化和繁殖管理提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)魚(yú)來(lái)自中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司中華鱘研究所，16齡以上的中華鱘子一代30尾，親本來(lái)源為1980～2000年的野生中華鱘；2009、2010和2011年從葛洲壩采集到的野生中華鱘魚(yú)卵孵化的苗種各10尾，共計(jì)30尾；2011、2012、2013年中華鱘研究所全人工繁殖的子二代中華鱘幼苗各10尾，共計(jì)30尾。分別采集少量鰭條，用無(wú)水乙醇固定。

1.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Wang等[21]報(bào)道的中華鱘MHC Ⅰa基因cDNA序列，利用Primer6.0設(shè)計(jì)中華鱘MHC Ⅰa基因PBR區(qū)特異引物：MHCⅠf（5′-TTTGAGTCCCTTGAGGCG-3′）和MHC Ⅰr（5′-TACAGACGAGCCGTGGAA-3′），目的片段大小為127 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

將無(wú)水乙醇固定保存的鰭條樣品剪碎，于70 ℃烘干使乙醇完全揮發(fā)。Qiagen基因組DNA提取試劑盒依據(jù)其說(shuō)明書(shū)進(jìn)行基因組DNA提取。1.0% Agarose凝膠電泳檢測(cè)后，并檢測(cè)其濃度和純度，然后將DNA濃度調(diào)整至200 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR反應(yīng)總體積為50 μL，正、反引物各0.4 μmol/L，模板DNA為40 ng。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序

50 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用Omega Gel Extraction Kit回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物按約3∶1的比例與pMD19-T（TakaRa）載體進(jìn)行連接，然后將連接產(chǎn)物5 μL用于轉(zhuǎn)化Ecoli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。根據(jù)藍(lán)白斑原理，篩選白色菌斑，接種至3 mL液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，用M13+/-引物菌液PCR檢測(cè)，鑒定含插入片段的菌株。菌液送至上海英駿生物工程有限公司采用自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 序列分析

獲得的序列通過(guò)NCBI中BLAST同源檢索，確認(rèn)是否為目的片段。用Clustal w進(jìn)行多序列比較，利用MEGA 7.0軟件分析DNA序列和氨基酸序列的變異位點(diǎn)，并輔以人工校對(duì)。利用DNasp 5.1進(jìn)行基因多態(tài)性分析和選擇壓力分析， 利用MEGA 7.0軟件采用kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建鄰接（Neighbor joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR序列擴(kuò)增

對(duì)90尾中華鱘的900個(gè)有效克隆進(jìn)行了測(cè)序和分析，經(jīng)過(guò)在GenBank中Blast保守區(qū)結(jié)構(gòu)域（Conserved domains）比對(duì)后發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增得到的序列位于中華鱘MHC Ⅰ基因α1-2結(jié)構(gòu)域內(nèi)，確認(rèn)其為中華鱘MHC Ⅰa基因PBR區(qū)內(nèi)的片段。序列經(jīng)對(duì)位排列和變異檢測(cè)后，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何插入、缺失或異常的密碼子。該核苷酸序列長(zhǎng)度為127 bp，編碼42個(gè)氨基酸。

2.2 MHC Ⅰa單倍型分離情況

中華鱘野生群體30個(gè)樣品265個(gè)有效克隆中共檢測(cè)出50條特異序列（單倍型），中華鱘子一代群體30個(gè)樣品的278個(gè)有效克隆中共檢測(cè)出66條特異序列（單倍型），中華鱘子二代群體30個(gè)樣品的257個(gè)克隆中檢測(cè)出64條特異序列（單倍型）。MHC Ⅰa單倍型分離情況見(jiàn)表1。

2009年野生樣品編號(hào)為A1-A10；2010年野生樣品編號(hào)為B1-B10；2011年野生樣品編號(hào)為C1-C10。2011年子二代樣品編號(hào)為D1-D10；2012年子二代樣品編號(hào)為E1-E10；2013年子二代樣品編號(hào)為F1-F10。子一代樣品編號(hào)為G1-G30。

中華鱘3個(gè)群體共有單倍型序列7條，其中Acsi-UAB*0101、Acsi-UAB*0103和Acsi-UAB*0105為主要優(yōu)勢(shì)單倍型，Acsi-UAB*0101單倍型數(shù)量占野生群體有效克隆總數(shù)的58.1%，Acsi-UAB*0103單倍型數(shù)量占野生群體有效克隆總數(shù)的10.9%，Acsi-UAB*0105單倍型數(shù)量占野生群體有效克隆總數(shù)的7.6%；Acsi-UAB*0101和Acsi-UAB*0103也是中華鱘子一代群體和子二代群體的優(yōu)勢(shì)單倍型，分別占子一代群體總數(shù)的38.8%和31.7%，占子二代群體總數(shù)的60.7%和10.1%。3個(gè)主要單倍型在中華鱘3個(gè)群體中的分布比例見(jiàn)表2。

2.3 3個(gè)群體序列多態(tài)性和遺傳多樣性

圖1是中華鱘野生群體50個(gè)單倍型的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，127 bp的核苷酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有53個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為41.73%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)25個(gè)，顛換位點(diǎn)18個(gè)，既有轉(zhuǎn)換又有顛換的位點(diǎn)10個(gè)。圖2是中華鱘野生群體50個(gè)單倍型的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，翻譯后序列長(zhǎng)為42個(gè)氨基酸，在23個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生替代，氨基酸序列多態(tài)性為54.76%。

圖3是中華鱘子一代群體66個(gè)單倍型的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，127 bp的核苷酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有64個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為50.39%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)30個(gè)，顛換位點(diǎn)24個(gè)，既有轉(zhuǎn)換又有顛換的位點(diǎn)10個(gè)。圖4是中華鱘野生群體66個(gè)單倍型的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，翻譯后的42個(gè)氨基酸序列在26個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生替代，氨基酸序列多態(tài)性為61.90%。

圖5是中華鱘子二代群體64個(gè)單倍型的核苷酸序列比對(duì)結(jié)果，127 bp的核苷酸序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)有62個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為48.82%。其中轉(zhuǎn)換位點(diǎn)31個(gè)，顛換位點(diǎn)22個(gè)，既有轉(zhuǎn)換又有顛換的位點(diǎn)9個(gè)。圖6是中華鱘野生群體66個(gè)單倍型的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果，翻譯后的42個(gè)氨基酸序列在24個(gè)氨基酸位點(diǎn)發(fā)生替代，氨基酸序列多態(tài)性為57.14%。

對(duì)3個(gè)中華鱘種群的遺傳多樣性分析顯示（表3）：?jiǎn)伪缎蛿?shù)目H最大的為子一代群體（66），其次為子二代群體（64），第三為野生群體（50）；單倍型多樣性h最大的為子一代群體（0.937），其次為子二代群體（0.898），第三為野生群體（0.879）；核苷酸多樣性指數(shù)π最大的為子一代群體（0.056），其次為野生群體（0.043），第三為子二代群體（0.015）。整體而言，子一代種群的各遺傳多樣性參數(shù)最高；子二代群體單倍型數(shù)和單倍型多樣性較野生群體更高，但是核苷酸多樣性、平均核苷酸差異數(shù)則低于野生群體。

2.4 同義替代和非同義替代

利用DNasp 5.0計(jì)算中華鱘MHC Ⅰa序列中的同義替代率（dn）和非同義替代率（ds），中華鱘野生群體的dn/ds為1.33，中華鱘子一代群體的dn/ds為1.03，中華鱘子二代群體的dn/ds為1.04（表4）。

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖7、圖8和圖9分別是中華鱘3個(gè)群體MHC Ⅰ基因基于kimura雙參數(shù)模型構(gòu)建鄰接（Neighbor joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。中華鱘3個(gè)群體MHC Ⅰ基因明顯地被分為兩大類(lèi)群，推測(cè)中華鱘 MHC Ⅰ基因可能存在兩個(gè)基因座位。由于部分單倍型序列差異較小，導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)某些節(jié)點(diǎn)自展值較低。

3 討論

3.1 中華鱘MHC Ⅰ基因多態(tài)性

目前，有關(guān)魚(yú)類(lèi)MHC基因多態(tài)性的研究較多。龐紀(jì)彩等[22]從廣東省 3 個(gè)不同羅非魚(yú)養(yǎng)殖地區(qū)采集的137尾尼羅羅非魚(yú)（Oreochromis niloticus）的個(gè)體基因組中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為775～796 bp片段的MHC ⅡB核苷酸序列，共檢測(cè)出49個(gè)單堿基突變位點(diǎn)；張玉喜等[9]對(duì)牙鲆84個(gè)個(gè)體的411個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)有13種不同的MHC ⅡB核苷酸序列，分別編碼13種不同的氨基酸序列。楊玲等[23]從擴(kuò)增的262 bp的草魚(yú)MHC Ⅰ基因核苷酸序列中，發(fā)現(xiàn)50個(gè)多態(tài)位點(diǎn)（19%），低于本研究變異率最小的野生群體（41.73%）。本研究中華鱘3個(gè)群體90個(gè)個(gè)體的800個(gè)克隆，共發(fā)現(xiàn)有157種不同的MHC Ⅰ核苷酸序列，表現(xiàn)出了豐富的基因多態(tài)性。中華鱘種群MHC Ⅰ基因多態(tài)性比其他養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)種群較高，一方面原因可能是其他養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)生活史較短，人工選育代數(shù)較多導(dǎo)致遺傳多樣性較低，而中華鱘由于生活史較長(zhǎng)，人工選育代數(shù)較少；另一方面原因在于中華鱘自身遺傳多倍性組成所致。

表2顯示了各單倍型在不同群體中的分布頻率，各單倍型在同一種群出現(xiàn)頻率差別很大，Acsi-UAB*0101在野生種群中出現(xiàn)的頻率最高，占58.1%，其次為Acsi-UAB*0103和Acsi-UAB*0105單倍型，它們出現(xiàn)的頻率分別為10.9%、7.55%。相同的單倍型在不同種群中出現(xiàn)的頻率差別也很大，另外大多數(shù)單倍型只出現(xiàn)一次，Acsi-UAB單倍型的高多態(tài)性和低頻率也反應(yīng)出MHC基因的高度變異性[24]。

3.2 選擇壓力

MHC基因型的多樣性，一般認(rèn)為是由雜種優(yōu)勢(shì)、分子進(jìn)化的中性理論和正向選擇引起的[25]。中性理論認(rèn)為在分子水平上的進(jìn)化產(chǎn)生的隨機(jī)漂移引起選擇性中性或接近中性的突變，是對(duì)MHC基因多態(tài)性的可能解釋。中華鱘3個(gè)群體的MHC Ⅰa非同義替代率與同義替代率之比均大于1，一般認(rèn)為非同義替換高于同義替換是由正向選擇作用產(chǎn)生的， 因此可以認(rèn)為在中華鱘進(jìn)化過(guò)程中，MHC Ⅰa主要受到正向選擇的影響， 而正向選擇正是MHC基因多態(tài)性的發(fā)生機(jī)制， 因此產(chǎn)生了眾多的等位基因。MHC蛋白是脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵分子，其主要功能是識(shí)別和結(jié)合抗原，并將抗原呈遞給T淋巴細(xì)胞。MHC蛋白識(shí)別和結(jié)合抗原的部位位于蛋白頂端的溝槽上，特別是PBR上的氨基酸殘基，因此，MHC基因或基因型對(duì)抗原結(jié)合有特異性[26，27]。

3.3 中華鱘3個(gè)群體MHC Ⅰ基因遺傳變異分析

本研究所用的中華鱘子一代樣品均為1980年至2000年初的野生中華鱘繁殖的后代，年齡結(jié)構(gòu)在16～29齡甚至更長(zhǎng)，野生來(lái)源樣品為2009、2010和2011年從葛洲壩采集的苗種。子一代中華鱘群體MHC Ⅰ基因遺傳多樣高于野生中華鱘群體，這表明近年來(lái)中華鱘野生種群MHC Ⅰ基因遺傳多樣呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其主要原因可能是中華鱘野生群體數(shù)量逐年下降。黃真理[28]建立了利用捕撈數(shù)據(jù)估算其資源量的理論和方法，對(duì)葛洲壩截流后的中華鱘資源量進(jìn)行了初步估算，發(fā)現(xiàn)中華鱘年際資源增長(zhǎng)率從1981年的6.92減少到1984年以后的0.793～0.956，1984年中華鱘資源量達(dá)到最大，其后逐年減少。危起偉等[29]研究葛洲壩截流24年來(lái)野生中華鱘產(chǎn)卵群體結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn)，中華鱘雌雄性比由1981～1983年的1.10∶1降低到1987～1989年的0.63∶1，而后上升到2003～2004年的5.86∶1，野生中華鱘產(chǎn)卵群體性別結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴(yán)重失衡。野生種群數(shù)量的減少，再加上性比失衡，加速了參與繁殖親魚(yú)數(shù)量的減少及種群遺傳多樣性的快速下降。野生中華鱘群體MHC Ⅰ基因遺傳多樣性小于人工種群的另一種可能是采樣年份參與繁殖的野生中華鱘群體相對(duì)較小。近年來(lái)中華鱘瀕危程度加劇，繁殖種群逐年下降，從而導(dǎo)致參與產(chǎn)卵親魚(yú)的數(shù)量比較少，2009、2010和2011年采集的野生中華鱘苗種可能均為少數(shù)親本個(gè)體所產(chǎn)生的后代，使得野生種群樣品代表性不足。子一代中華鱘群體MHC Ⅰ基因遺傳多樣性高于子二代中華鱘群體，則表明子二代在傳遞過(guò)程中遺傳多樣性有所丟失的現(xiàn)象。因此，在人工種群遺傳管理上，繁殖親魚(yú)配對(duì)上盡可能選擇MHC基因型不同的個(gè)體進(jìn)行繁殖配對(duì)，而且盡可能兼顧到稀有MHC基因型的傳代問(wèn)題，最大化減少稀有基因型的丟失。

MHC基因的遺傳多樣性與魚(yú)類(lèi)對(duì)疾病的抵抗力密切相關(guān)。Landis等[30]發(fā)現(xiàn)虹鱒的MHC Ⅰb基因在病毒感染后表達(dá)量上升；楊玲等[23]對(duì)草魚(yú)MHC class Ⅰ基因多態(tài)性及其與魚(yú)體抗柱形病能力的關(guān)系進(jìn)行了研究分析，發(fā)現(xiàn)有6種等位基因只出現(xiàn)在抗病個(gè)體中，有7種等位基因只出現(xiàn)在染病個(gè)體中，顯示MHC Ⅰ基因可以作為分子遺傳標(biāo)記進(jìn)行抗病相關(guān)標(biāo)記輔助育種；胡丹丹[31]研究虹鱒MHC Ⅰ基因第2外顯子等位基因與抗傳染性造血器官壞死?。↖HN）性狀的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，4種等位基因與抗病性狀高度相關(guān)，3種等位基因與IHN易感性相關(guān)，并找出兩種抗性群體中的優(yōu)勢(shì)等位基因。目前，本研究?jī)H停留在群體遺傳多樣性層面，更深入研究將在個(gè)體水平上探索抗病性個(gè)體及疾病易感個(gè)體與某種類(lèi)型MHC單倍型連鎖關(guān)系，將更有利于中華鱘人工種群管理和繁殖對(duì)策制定。

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