王領(lǐng)弟，臧亞茹，邢 婧，劉振華，徐寶欣，潘海峰△

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

山楂葉黃酮類成分的測(cè)定方法研究進(jìn)展*

王領(lǐng)弟1，臧亞茹1，邢 婧1，劉振華1，徐寶欣2，潘海峰2△

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)

山楂葉；黃酮類成分；測(cè)定方法；質(zhì)量控制

山楂葉作為常用中藥材被收載于《中國(guó)藥典》2010版一部，具有活血化瘀、理氣通脈、化濁降脂的作用，用于氣滯血瘀、胸痹心痛、胸悶憋氣、心悸健忘、眩暈耳鳴和高脂血癥[1]。研究表明，山楂葉生理活性的主要成分為黃酮類成分，包括牡荊素、牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、金絲桃苷、蘆丁、槲皮素等[2-6]。本文就近年來(lái)對(duì)山楂葉黃酮類成分的測(cè)定方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 黃酮類成分的定性檢測(cè)

1.1 顯色反應(yīng)

1.1.1 紫外光下呈色反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，在可見光下呈灰黃色，在紫外光下呈棕色并有熒光斑點(diǎn)。

1.1.2 三氯化鋁反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%三氯化鋁乙醇溶液，吹干呈灰黃色，在紫外光下呈黃綠色熒光斑點(diǎn)。

1.1.3 氨水反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙?jiān)诎彼戏窖敕昼?，立即在紫外光下觀察，呈黃綠色熒光斑點(diǎn)。

1.1.4 鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液1ml于試管中，加適量鎂粉，滴加濃鹽酸數(shù)滴，呈桃紅色泡沫反應(yīng)。

1.1.5 鋯-枸櫞酸反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液1ml于試管中，滴加2%氫氧化鋯，此時(shí)溶液呈黃色；再滴加2%枸櫞酸甲醇溶液，并加水稀釋，此時(shí)黃色減退，再加水則為無(wú)色。

1.1.6 乙酸鎂反應(yīng)：取山楂葉樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%乙酸鎂甲醇溶液，吹干，紫外光下呈黃色斑點(diǎn)。

1.2 紙層析 取山楂葉樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，用正丁醇-醋酸-水=4：1：5為展開劑，上行展開4小時(shí)，取出晾干。噴1%氯化鋁乙醇溶液，吹干后于紫外燈下檢視，可見相應(yīng)熒光斑點(diǎn)。

1.3 聚酰胺薄膜色譜法 取山楂葉樣品溶液點(diǎn)在聚酰胺薄膜上，以醋酸為展開劑，展開后晾干。噴1%三氯化鋁醇溶液，吹干后于紫外燈下檢視，可見相應(yīng)熒光斑點(diǎn)[7]。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用法 液質(zhì)聯(lián)用（HPLC-MS）是以液相色譜作為分離系統(tǒng)、質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)，樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。喬曉莉等[8]以0.1%甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相，采用UPLC/ESI-TOF/MS獲得山楂化學(xué)成分的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，高效、準(zhǔn)確地鑒別了牡荊素葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮素等黃酮類成分。許紅蕾等[9]以乙腈-0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，通過(guò)液相色譜-二極管陣列光譜檢測(cè)-電噴霧離子化質(zhì)譜（HPLC-DAD/ESI-MS）聯(lián)用技術(shù)，定性分析出山楂葉中牡荊素、牡荊素-2"-O-鼠李糖苷、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-鼠李糖-半乳糖苷、牡荊素-4"-O-乙酰-2"-O-鼠李糖苷等黃酮類成分， 該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)。

2 黃酮類成分的定量測(cè)定

2.1 分光光度法 分光光度法是通過(guò)測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長(zhǎng)處或一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)光的吸光度或發(fā)光強(qiáng)度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。張文莉等[10]采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH和AlCl3兩種顯色系統(tǒng)，以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外-可見分光光度法測(cè)定山楂葉提取物中總黃酮的含量。結(jié)果：NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法（510nm）測(cè)定含量為86.15%，AlCl3顯色法（272nm）測(cè)定含量為35.19%，兩種方法所得測(cè)定結(jié)果相差較大，但對(duì)于何種方法更適合用于山楂葉提取物中總黃酮的測(cè)定還有待進(jìn)一步研究。楊少冉等[11]用紫外-可見分光光度法測(cè)定了不同采收期承德產(chǎn)山楂葉中總黃酮的含量，進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，結(jié)果以6月份所含總黃酮含量最高。

2.2 三波長(zhǎng)分光光度法 在雙波長(zhǎng)測(cè)定方式中，一般是尋找干擾成分的等吸光點(diǎn)，從而使整個(gè)吸收光譜上下平移來(lái)消除干擾成分的影響，但往往會(huì)碰到干擾成分的吸收光譜沒有吸收峰，因而找不到合適的等吸光點(diǎn)的情況，此時(shí)用雙波長(zhǎng)法必然會(huì)影響測(cè)定的準(zhǔn)確度。三波長(zhǎng)分光光度法除了能將吸收光譜上下平移，也能校正它的傾斜度，因而當(dāng)在干擾成分的吸收光譜上找不到等吸光點(diǎn)時(shí)，應(yīng)用三波長(zhǎng)測(cè)定法更加準(zhǔn)確[12-13]。張?zhí)m杰等[14]以λ1=463nm、λ2=417nm、λ3=382nm的三波長(zhǎng)分光光度法測(cè)定山楂葉、果總黃酮的含量，有效地消除了吸收峰不對(duì)稱給黃酮定量分析造成的影響，并校正了干擾組分的吸收光譜產(chǎn)生的基線傾斜，提高了定量分析的準(zhǔn)確度。

2.3 高效液相色譜法 高效液相色譜（HPLC）是以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。因具有操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好和專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，HPLC法已廣泛應(yīng)用于山楂葉黃酮類成分的含量測(cè)定。王肖等[15]以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C）為流動(dòng)相，用HPLC法對(duì)山楂葉樣品溶液進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)不同月份的承德產(chǎn)山楂葉中牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷進(jìn)行了含量測(cè)定，結(jié)果：牡荊素葡萄糖苷、牡荊素鼠李糖苷和金絲桃苷的含量均以6月份最高，牡荊素和蘆丁的含量均以7月份最高。張文潔等[16]以甲醇-乙腈-四氫呋喃-0.4%醋酸水（6：：1.5：18.5：74）為流動(dòng)相，首次采用HPLC法梯度洗脫對(duì)山楂葉總黃酮中多酚類成分的藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，確定了牡荊素-4"-O-葡萄糖苷（VG）、牡荊素-2"-O-鼠李糖苷(VR)和牡荊素(VIT)在血漿樣品中含量的測(cè)定方法，該方法專屬性強(qiáng)，分離度較好。張雪瑩等[17]采用多波長(zhǎng)RP-HPLC法，以乙腈（A）-0.025mol/ml磷酸水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果：在檢測(cè)波長(zhǎng)為363nm（0-18min）和371nm（18-30min）的條件下，同時(shí)測(cè)定出了山楂葉中蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量，該方法快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

2.4 微乳液相色譜法 微乳液相色譜（MEIC）應(yīng)用較多的是水包油型反相MEIC，其分離機(jī)制是溶質(zhì)在固定相、偽固定相（表面活性劑在固定相的吸附層）、多相分散相（微乳液滴）、水相進(jìn)行的動(dòng)態(tài)吸附解析過(guò)程。由于分離過(guò)程的復(fù)雜性，可控參數(shù)較多，使得具有不同極性的組分在等度洗脫下，在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到有效分離。李寧等[18]以SDS-正辛醇-正丁醇和Brij35-正辛醇-正丁醇微乳體系為流動(dòng)相，選擇Venusil ASB C18色譜柱對(duì)山楂葉提取物進(jìn)行分離，穩(wěn)定、快速地測(cè)定出了山楂葉提取物中牡荊素鼠李糖苷、蘆丁、牡荊素、金絲桃苷4種黃酮類成分的含量。

2.5 超高效液相色譜法 超高效液相色譜（UPLC）借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。劉亭亭等[19]以乙腈（A）-0.3%甲酸水（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫方式，用UPLC法對(duì)含山楂葉成分的三葉片中蘆丁和金絲桃苷的溶出度進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果準(zhǔn)確，可重復(fù)性好。

2.6 一測(cè)多評(píng)法 一測(cè)多評(píng)是指利用中藥有效成分內(nèi)在的函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系，只測(cè)定一個(gè)成分（對(duì)照品可得到者）實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分（對(duì)照品難以得到或難供應(yīng)）的同步測(cè)定。一測(cè)多評(píng)法經(jīng)濟(jì)、方便、高效，既能解決中藥對(duì)照品匱乏的問題，又能實(shí)現(xiàn)中藥及其制劑的多組分定量。楊明宇等[20]以流動(dòng)相0.1%甲酸（A）-乙腈（B）-四氫呋喃（C） 進(jìn)行梯度洗脫，以牡荊素葡萄糖苷為內(nèi)參物，計(jì)算山楂葉中牡荊素葡萄糖苷對(duì)牡荊素鼠李糖苷、牡荊素、蘆丁、金絲桃苷的RCF值，進(jìn)而進(jìn)行含量測(cè)定，相對(duì)誤差均小于5%，符合考量尺度。

3 小結(jié)

山楂葉含有的黃酮類成分在心腦血管系統(tǒng)[21-22]和抗腫瘤方面[23-24]的臨床應(yīng)用具有廣闊的發(fā)展前景。目前，對(duì)黃酮類成分的研究越來(lái)越深入，對(duì)其結(jié)構(gòu)分析要求也越來(lái)越高。通過(guò)對(duì)山楂葉黃酮類成分的測(cè)定方法研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以期為研究人員提供更全面的參考依據(jù)。

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A

1004-6879（2017）05-0424-04

2016-12-15）

* 河北省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2016190），承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（201601A043），河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2015097）

△ 通訊作者