魯兗+沈耐濤+虞和永

[摘要]對(duì)龍州山橙的生物堿類(lèi)成分進(jìn)行研究。采用硅膠柱色譜、反相柱色譜、高效制備液相等方法，對(duì)龍州山橙的總生物堿進(jìn)行分離和純化，并通過(guò)1H，13CNMR，MS等波譜方法鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。該研究共分離得到7個(gè)生物堿類(lèi)化合物，分別為scandine（1），tabersonine（2），melodinine N（3），melodinine P（4）， melodinine T（5），19epimeloscandonine（6），16hydroxy19Svindolinine（7）。化合物均1～7為首次從該植物中分離得到。采用MTT 法對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行體外抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)化合物1～7均表現(xiàn)出一定的體外細(xì)胞毒活性。

[關(guān)鍵詞]山橙屬； 龍州山橙； 生物堿； 抗腫瘤活性

Studies on alkaloids from Melodinus moraei

LU Yan， SHEN Naitao， YU Heyong*

（The Fourth Affiliated Hospital， College of Medicine， Zhejiang University， Yiwu 322000， China）

[Abstract]To study the alkaloids from Melodinus moraei，seven compounds were separated and purified by column chromatography over silica gel， reverse phase silica gel and preparative HPLC Their chemical structures were elucidated by MS and spectral data （1HNMR， 13CNMR） as scandine（1），tabersonine（2），melodinine N（3），melodinine P（4）， melodinine T（5），19epimeloscandonine（6），16hydroxy19Svindolinine（7） Compounds 17 were isolated from M moraei for the first time.The bioassays showed all tested samples displayed antitumor activity against the cell lines such as A549，PC3，HGC27 and HL60

[Key words]Melodinus； Melodinus moraei； alkaloids； antitumor activity

山橙屬植物全球約有53個(gè)種，主要分布在亞洲熱帶地區(qū)及大洋洲，我國(guó)有11個(gè)種，華南、西南及臺(tái)灣等省或地區(qū)為主要產(chǎn)地[1]。該屬植物富含單萜吲哚生物堿類(lèi)成分，該類(lèi)生物堿結(jié)構(gòu)復(fù)雜新穎，生物活性顯著，近年來(lái)引起了一些學(xué)者的關(guān)注[24]。龍州山橙Melodinus moraei Tsiang，系夾竹桃科山橙屬植物。該屬植物全球約有53個(gè)種，主要分布在亞洲熱帶地區(qū)及大洋洲，我國(guó)有11個(gè)種，華南、西南及臺(tái)灣等省區(qū)為主要產(chǎn)地[1]。山橙屬植物富含單萜吲哚生物堿類(lèi)成分，該類(lèi)生物堿結(jié)構(gòu)復(fù)雜新穎，生物活性顯著，近年來(lái)引起了一些學(xué)者的關(guān)注[24]。龍州山橙主要分布于廣西，民間常用于治療腦膜炎、風(fēng)濕性心臟病等[5]。目前對(duì)龍州山橙化學(xué)成分的研究報(bào)道較少，因此研究龍州山橙的生物堿類(lèi)成分是一項(xiàng)非常有意義的工作， 可藉此發(fā)現(xiàn)具有藥理活性的前體化合物用于藥物研制。利用硅膠柱色譜，反相柱色譜，制備液相色譜等分離手段，對(duì)龍州山橙的生物堿類(lèi)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并從中分離得到了7個(gè)化合物。分別鑒定為scandine（1），tabersonine（2），melodinine N（3），melodinine P（4）， melodinine T（5），19epimeloscandonine（6），16hydroxy19Svindolinine（7）?；衔锞?～7為首次從該植物中分離得到。

1材料

11儀器Bruker DRX500 MHz 核磁共振波譜儀（瑞士，TMS為內(nèi)標(biāo)）；Agilent Technonlgies 6520 質(zhì)譜儀（美國(guó)），LABOROTA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道夫公司），Shimadazu LC6AD制備型高效液相色譜儀（日本島津公司），YMC ODSA （20 mm×250 mm， 5 μm）色譜柱。

色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；反相Rp18硅膠（德國(guó)默克公司）；提取分離用試劑均為分析純；制備HPLC用乙腈為色譜純（瑞典Oceanpak公司），水為重蒸水。

12細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)所用的肺癌A549，前列腺癌PC3，胃癌HGC27 和白血病細(xì)胞HL60細(xì)胞株均購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

13藥材樣品采于2013年采自廣西龍州，經(jīng)虞和永教授鑒定為龍州山橙M moraei。

2提取分離

龍州山橙干燥莖枝5 kg，粉碎，用95%加熱回流提取3次，每次2 h，濃縮后得總浸膏450 g。浸膏溶于2%鹽酸中，過(guò)濾，濾液用氨水堿化，調(diào)pH 9～10，然后用氯仿萃取，回收氯仿，得總生物堿56 g?？偵飰A經(jīng)堿性硅膠柱色譜，氯仿甲醇洗脫。得到A～E 5個(gè)部分。其中C部分進(jìn)一步利用反相硅膠柱色譜、制備液相色譜（乙腈水為流動(dòng)相，45∶55），分別得到化合物1（15 mg，tR=98 min），2（9 mg， tR=125 min），3（10 mg，tR=227 min）和 4（26 mg，tR=421 min）。D部位經(jīng)硅膠柱色譜（環(huán)己烷乙酸乙酯二乙胺，6∶4∶1）得到化合物5 （12 mg）。E部位經(jīng)硅膠柱色譜分離，以氯仿甲醇（8∶1）洗脫，得E1～E8部分，其中E2部分有白色固體析出，過(guò)濾重結(jié)晶得到化合物6 （34 mg），其母液再經(jīng)過(guò)制備液相色譜純化得化合物化合物7 （18 mg）。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1淡黃色粉末。ESIMS m/z 3510 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：369（1H，m，H3a），333（1H，dd，J=180 Hz，90 Hz，H3b），362 （1H，m，H5a），360 （1H，m，H5a），389 （1H，m，H6a），381 （1H，m，H6b），782 （1H，d，J=45 Hz，H9），722 （1H，d，J=75Hz，H10），721 （1H，d，J=75 Hz，H11），690 （1H，d，J=75 Hz，H12），574 （1H，m，H14），592 （1H，d，J=100 Hz，H15），312 （1H，d，J=135 Hz，H17a），265 （1H，d，J=135 Hz，H17b），575 （1H，m，H18a），500 （1H，dd，J=175，105 Hz，H18b），564 （1H，dd，J=175，105 Hz，H19），290 （1H，s，H21）；13CNMR （CDCl3，125 MHz） δ：1673 （C2），450 （C3），531 （C5），389 （C6），591 （C7），1281 （C8），1292 （C9），1245 （C10），1274 （C11），1158 （C12），1346 （C13），1221 （C14），1310 （C15），624 （C16），440 （C17），1153 （C18），1402 （C19），459 （C20），839 （C21），1692 （C=O），529（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]對(duì)比，故鑒定化合物1為scandine。

化合物2淡黃色粉末。ESIMS m/z 3373 [M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：074（3H，s，H18），126 （2H，dd，J=125 Hz，H19），376 （3H，s，OCH3 ），575 （1H，d，J=100 Hz，H15），590 （1H，s，H14），597 （1H，s，H12），682 （1H，d，J=65 Hz，H11），724 （1H，s，H10），790 （1H，br s，H9），901 （1H，s，NH）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物2為tabersonine。

化合物3白色粉末。ESIMS m/z 3693[M+H]+。1HNMR（CD3OD，500 MHz） δ：301（1H，s，H3a），342（1H，d，J=130 Hz，H3b），265（1H，m，H5a），301（1H，overlap，H5b），162（1H，dd，J=108，36 Hz，H6a），195（1H，m，H6b），712（1H，s，H9），640（1H，s，H12），580（1H，dd，J=90，42 Hz，H14），572（1H，d，J=90 Hz，H15），258（1H，d，J=148 Hz，H17a），265（1H，d，J=148 Hz，H17b），068（3H，t，J=72 Hz，H18），078（1H，m，H19a），094（1H，m，H19b），254（1H，s，H21），210（1H，s，H22），194（3H，s，CH3），13CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1679（C2），500（C3），501（C5），441（C6），550（C7），1242（C9），1220（C10），1605（C11），958（C12），1435（C13），1242（C14），1321（C15），285（C17），75（C18），258（C19），410（C20），691（C21），295（C22），2089（C=O）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物3為melodinine N。

化合物4淡黃色粉末。ESIMS m/z 3371[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：900（1H，s，H1），310（1H，d，J=102 Hz，H3a），341（1H，ddd，J=102，48，15 Hz，H3b），265（1H，s，H5a），301（1H，t，J=78 Hz，H5b），167（1H，dd，J=114，36 Hz，H6a），298（1H，m，overlap，H6b），665（1H，d，J=24 Hz，H9），668（1H，dd，J=78，24 Hz，H11），690（1H，d，J=78 Hz，H12），570（1H，ddd，J=15，48，96 Hz，H14），573（1H，d，J=96 Hz，H15），240（1H，d，J=150 Hz，H17a），254（1H，d，J=15 Hz，H17b），068（1H，t，J=78 Hz，H18），086（1H，m，H19a），098（1H，m，H19b），268（1H，s，H21），360（3H，s，OOCCH3），3CNMR（CDCl3，125 MHz）δ：1665（C2），507（C3），509（C5），442（C6），554（C7），1410（C8），1109（C9），1521（C10），1142（C11），108（C12），1370（C13），1248（C14），1327（C15），901（C16），295（C17），78（C18），264（C19），430（C20），705（C21），1674（OOCCH3），501（OOCCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[7]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物 4為melodinine P。

化合物5淡黃色粉末。ESIMS m/z 3672[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz）δ：782（1H，s，H1），324（1H，m，H3），308（1H，dd，J=55，130 Hz，H5a），320（1H，m，H5b），200（1H，m，H6a），250（1H，m，H6b），745（1H，d，J=78 Hz，H9），710（1H，t，J=78 Hz，H10），719（1H，t，J=78 Hz，H11），684（1H，d，J=78 Hz，H12），595（1H，dd，J=36，102Hz，H14），602（1H，d，J=102 Hz，H15），254（1H，d，J=138 Hz，H17a），335（1H，d，J=138 Hz，H17b），220（1H，s，H18），418（1H，s，H21），555（3H，s，OOCCH3），3CNMR（CDCl3，125 MHz） δ：1671（C2），473（C3），525（C5），362（C6），596（C7），1280（C8），1265（C9），1235（C10），1270（C11），1150（C12），1343（C13），1277（C14），1269（C15），622（C16），418（C17），244（C18），2058（C19），554（C20），740（C21），1692（OCH3），531（OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物5為melodinine T。

化合物6淡黃色粉末。ESIMS m/z 3213[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：790（1H，s，H1），378（1H，d，J=186 Hz，H3a），340（1H，dd，J=30，186 Hz，H3b），325（1H，dd，J=12，90Hz，H5a），310（1H，dd，J=78，90 Hz，H5b），230～205（5H，m，H6，17，19），717（1H，d，J=75 Hz，H9），702（1H，t，J=75，78 Hz，H10），719（1H，t，J=75，78Hz，H11），594～591（2H，m，H14，15），092（1H，d，J=72 Hz，H18），360（1H，s，H21） 192 （3H，s，CH3）。13CNMR （CDCl3，125 MHz） δ：1688（C2），472（C3），545（C5），380（C6），569（C7），1307（C8），1241（C9），1240（C10），1283（C11），1165（C12），1376（C13），1259（C14），1269（C15），678（C16），386（C17），87（C18），525（C19），458（C20），619（C21），2094（C=O）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物6為19epimeloscandonine。

化合物7淡黃色粉末。ESIMS m/z 3532[M+H]+。1HNMR（CDCl3，500 MHz） δ：416（1H，dd，J=48，18 Hz，H3a），343（1H，d，J=174 Hz，H3b），380（1H，m，H5a），325（1H，dd，J=102，174 Hz，H5b），214（1H，dd，J=66，156 Hz，H6a），195（1H，m，H6b），732（1H，d，J=72 Hz，H9），681（1H，d，J=78 Hz，H10），706（1H，t，J=72，78 Hz，H11），675（1H，d，J=72 Hz，H12），587（1H，m，H14），629（1H，dd，J=30，96 Hz，H15），295（1H，d，J=15 Hz，H17a），160（1H，d，J=15 Hz，H17b），062（1H，d，J=72 Hz，H18），295（1H，q，J=72 Hz，H19），290（1H，s，H21），378（3H，s，OCH3）。13CNMR（CDCl3，125 MHz） δ：490（C3），568（C5），414（C6），580（C7），1366（C8），1230（C9），1215（C10），1283（C11），1118（C12），1484（C13），1279 （C14），1315（C15），840（C16），364（C17），97（C18），510（C19），448（C20），721（C21），1725（COOCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]數(shù)據(jù)對(duì)比，鑒定化合物7為16hydroxy19Svindolinine。

4腫瘤細(xì)胞毒活性測(cè)試

采用MTT法，測(cè)試了化合物1～7在不同濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞株肺癌A549，前列腺癌PC3，胃癌HGC27 和白血病細(xì)胞HL60的抑制活性。實(shí)驗(yàn)具體操作參照文獻(xiàn)方法[10]進(jìn)行，結(jié)果見(jiàn)表1。發(fā)現(xiàn)化合物1～7均表現(xiàn)出一定的體外細(xì)胞毒活性。

魯兗等：龍州山橙的生物堿類(lèi)成分研究

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[責(zé)任編輯丁廣治]

[收稿日期]20161108

[通信作者]*虞和永，主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作，Tel：（0579）89935396，Email：yuhy@zjueducn