龍 剛 綜述,黃 文 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科 400016)

生物治療在下肢缺血性疾病中的應(yīng)用

龍 剛 綜述,黃 文△審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科 400016)

下肢缺血性疾??；生物治療；細(xì)胞治療；生長因子

下肢缺血性疾病是可以導(dǎo)致患者截肢甚至死亡的嚴(yán)重疾病，主要包括下肢動(dòng)脈硬化性閉塞癥、血栓閉塞性脈管炎(Buerger′s病)、糖尿病肢體動(dòng)脈閉塞癥等，大多是繼發(fā)于動(dòng)脈粥樣硬化、動(dòng)靜脈栓塞或血栓形成、糖尿病等，具有發(fā)病率、致殘率和致死率高等特點(diǎn)[1]。其病因可能與飲食的攝入、吸煙、血液的高凝狀態(tài)、血糖異常波動(dòng)等相關(guān)，而發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，可能與非特異性炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的血管炎癥有關(guān)[2]。目前的主要治療手段有擴(kuò)血管藥物治療、手術(shù)和微創(chuàng)介入重建血管等[3]。但上述傳統(tǒng)治療手段對嚴(yán)重血管病變尤其是無流出道的膝下病變治療效果欠佳，以“血管新生”為基礎(chǔ)的生物治療為下肢缺血性疾病的臨床研究提供了新的方向[4]。目前對于下肢缺血性疾病的生物治療大致分為細(xì)胞治療和生長因子治療。

1 細(xì)胞治療

1.1臍血干細(xì)胞治療 臍血干細(xì)胞是一類以分化潛能為特點(diǎn)的祖細(xì)胞，具有形成集落、增殖、分化的能力，由于臍血免疫原性較弱，使其不易被免疫排斥、能夠在體內(nèi)長期存活。臍血干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化成內(nèi)皮祖細(xì)胞并分泌多種細(xì)胞因子對缺血肢體內(nèi)的新生血管形成有促進(jìn)作用，可改善肢體血流。對患有Buerger′s病的下肢進(jìn)行臍血干細(xì)胞移植治療，效果顯示疼痛癥狀明顯緩解，皮膚潰瘍愈合，遠(yuǎn)端血管造影顯示大量毛細(xì)血管形成[5]。有人將臍血干細(xì)胞應(yīng)用于有缺血、潰瘍的模型，證實(shí)來源于臍血的內(nèi)皮前體細(xì)胞參與新生血管形成[6]。有研究將人臍血干細(xì)胞注射在下肢缺血患者肌肉的多個(gè)部位，發(fā)現(xiàn)其可改善冰涼、疼痛等癥狀[7]。但臍血干細(xì)胞移植技術(shù)仍存在一些問題：(1)無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)以便于提取更高純度內(nèi)皮祖細(xì)胞；(2)其相應(yīng)納入標(biāo)準(zhǔn)及劑量和療程需量化及規(guī)范；(3)其祖細(xì)胞向目的細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖與分化機(jī)制尚不明確，且增殖的程度和速度無法控制[8]。

1.2外周血干細(xì)胞治療 外周血干細(xì)胞是指游離在循環(huán)血中的干細(xì)胞，其不但能多向分化還能不斷更新。存在于其中的祖細(xì)胞被定向誘導(dǎo)后可以分化為內(nèi)皮細(xì)胞[9]。將其注射于缺血組織后，內(nèi)皮祖細(xì)胞局部的高濃度有利于其存活，而低氧的組織環(huán)境有助于提高內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖分化能力促進(jìn)血管新生效應(yīng)[10]。有學(xué)者將外周血干細(xì)胞移植于有下肢缺血性潰瘍形成的肢體中，觀察療效顯示大部分患肢癥狀好轉(zhuǎn)[11]。黃平平等[12]把該細(xì)胞移植技術(shù)應(yīng)用于下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥患者，結(jié)果患肢相應(yīng)缺血癥狀好轉(zhuǎn)，踝肱指數(shù)上升且影像學(xué)提示有新生血管形成。有研究使用此法治療缺血性下肢血管病明確了該移植技術(shù)可明顯改善缺血患肢的微循環(huán)情況[13]。但外周血干細(xì)胞移植具體機(jī)制尚未明確，未分化干細(xì)胞可能在該部位非定向分化或過量堆積而形成瘤樣組織，遠(yuǎn)期是否存在致瘤性、致突變等不良反應(yīng)，其對應(yīng)的存活、增殖轉(zhuǎn)化情況及移植后效果評價(jià)有待解決[14]。

1.3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞也具有一定多向分化的能力。2002年Tateishi-Yuyama等[15]于臨床上使用此干細(xì)胞針對下肢缺血性疾病的移植治療，并取得成功。國內(nèi)有專家應(yīng)用此移植技術(shù)治療糖尿病足，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血下肢有新生側(cè)支血管形成，患肢的缺血癥狀緩解[16]。國外有研究表明，骨髓干細(xì)胞通過改善組織灌注在治療重癥下肢缺血癥中具有良好的效果[17]。其作用機(jī)制可能為在組織缺損及相對缺血缺氧條件下可啟動(dòng)特異性基因表達(dá)，分泌細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白，使間充質(zhì)干細(xì)胞不斷分化[18]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植目前同樣存在缺乏客觀的指標(biāo)及有效的療效評價(jià)體系等問題[19]。

2 生長因子治療

2.1血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)治療 VEGF能作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成，在血管發(fā)生和血管形成過程中起重要作用，多種促血管生長因子如血小板源性生長因子、間質(zhì)細(xì)胞源性因子、腫瘤壞死因子等通過增強(qiáng)VEGF的表達(dá)起作用[20]。根據(jù)作用方式的不同可分為VEGF蛋白治療與VEGF基因治療。VEGF蛋白治療是利用 VEGF蛋白制劑根據(jù)治療需要反復(fù)多次給藥，不但價(jià)格昂貴而且需反復(fù)多次操作，但隨著基因技術(shù)的不斷發(fā)展和探索，使用載體維持 VEGF有效濃度促進(jìn)血管新生得以應(yīng)用。Sun等[21]采用特殊的方法將 VEGF混入特制的可降解復(fù)合材料中置于下肢缺血模型中,最終緩釋的VEGF血管生成作用得到肯定。VEGF基因治療則是將含有VEGF的活性基因片段導(dǎo)入目的細(xì)胞中進(jìn)行治療。Tsurumi等[22]直接將VEGF基因?qū)雱?dòng)物下肢缺血模型中，發(fā)現(xiàn)大量的新生血管形成且局部組織存在目的基因及相關(guān)蛋白表達(dá)。VEGF有很強(qiáng)的誘導(dǎo)新生血管形成的作用，但臨床應(yīng)用中存在量效和時(shí)效的局限性[23]；它不但能增加血管通透性導(dǎo)致組織水腫，還可能引發(fā)或加重腫瘤、增殖性視網(wǎng)膜病變等[24]。

2.2成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)治療 FGF主要以堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和酸性成纖維細(xì)胞生長因子(eFGF)為主，而bFGF的作用大于eFGF。bFGF對不同來源的細(xì)胞其促進(jìn)增殖及分化效果不同，其中中胚層細(xì)胞效率最高。能夠有效地誘導(dǎo)核細(xì)胞分化為目的細(xì)胞，從而促進(jìn)新生血管形成[25]。bFGF可促進(jìn)缺血組織的血管再生，Baffour等[26]發(fā)現(xiàn)在缺血組織注入bFGF后，缺血組織活力明顯改善，新生的毛細(xì)血管數(shù)量也顯著增加，不但增加了缺血組織的血液灌注量，而且也加快了組織微血管再生。但bFGF可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞新生，還能誘發(fā)其他血管細(xì)胞的病理性增殖從而導(dǎo)致進(jìn)一步狹窄、腫瘤形成，同時(shí)可引起血壓下降、血紅蛋白降低、腎臟疾病等[27]。

2.3肝細(xì)胞生長因子(HGF)治療 HGF又稱離散因子(scatter factor),屬纖溶酶原相關(guān)性生長因子(PRGF)家族中的一種可溶性細(xì)胞因子,由間質(zhì)細(xì)胞合成分泌,通過不同分泌方式對組織及細(xì)胞起作用。HGF是間質(zhì)和上皮/內(nèi)皮細(xì)胞間相互作用的重要信息分子，對胚胎發(fā)育、組織器官再生、傷口愈合和血管發(fā)生起重要的調(diào)節(jié)作用[28]。HGF促進(jìn)血管生成是通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和刺激血管平滑肌細(xì)胞而起作用,因其不刺激平滑肌細(xì)胞增殖故可防止內(nèi)膜所致管腔狹窄[29]。HGF受體是由A、B亞基組成的異二聚體蛋白，它與受體c-Met結(jié)合后通過激活如Ras/RAF、PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT、Crk/C3G/Rap1等促進(jìn)血管生成，還可以通過上調(diào)VEGF、FGF、NO等間接地參與血管的生成[30]。但是HGF仍然存在在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間短、有效濃度不穩(wěn)定等劣勢，限制了其進(jìn)一步的發(fā)展?；蜣D(zhuǎn)染可有效解決這一劣勢，其載體主要包括病毒與非病毒載體，病毒載體通過整合靶基因或與宿主基因融合表達(dá)目的基因，但存在安全性、轉(zhuǎn)導(dǎo)成功率低等問題[31]。非病毒載體中脂質(zhì)體因帶電荷與相應(yīng)物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)后半衰期縮短[32]，且與靶細(xì)胞結(jié)合后易引起免疫反應(yīng)或被降解[33]，多聚物載體潛在毒性和效率問題,目前仍在研究中。質(zhì)粒DNA載體刪除與人基因組可能同源的序列，以及在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所不需要的序列，不與宿主基因整合，隨著宿主染色體復(fù)制而復(fù)制[34]，隨細(xì)胞分裂而分離到子代細(xì)胞中，其攜帶的目的基因可持續(xù)表達(dá)，故而質(zhì)粒載體具有安全性好、體內(nèi)維持時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)[35]。含HGF基因的重組質(zhì)粒pUDK-HGF能夠有效轉(zhuǎn)移于完全缺血和部分缺血的肢體肌肉組織，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染橫紋肌細(xì)胞后，可利用橫紋肌細(xì)胞的蛋白合成系統(tǒng)，合成和分泌具有促進(jìn)血管生長作用的HGF蛋白分子，誘導(dǎo)阻塞的動(dòng)脈外膜表面的毛細(xì)血管萌芽出新血管，逐漸擴(kuò)大連接到遠(yuǎn)端動(dòng)脈[36-37]，從而形成新生血管并建立側(cè)支循環(huán)。有研究使用含有人HGF基因的載體注射于下肢缺血的動(dòng)物模型中,結(jié)果顯示在缺血區(qū)域存在目的蛋白且該區(qū)域有大量血管新生[38]，證實(shí)載體與目的蛋白存在量效關(guān)系。與VEGF、FGF相比，HGF不但具有抗炎抗氧化、促進(jìn)血管新生，而且能夠抑制炎癥、水腫和細(xì)胞衰老。pUDK-HGF有抗纖維化作用，能減少組織再生障礙，而VEGF和FGF能誘導(dǎo)組織纖維化，加重組織再生障礙。pUDK-HGF刺激產(chǎn)生的新生血管成熟較早，避免了向基質(zhì)中釋放血細(xì)胞起源的其他細(xì)胞，HGF在其促進(jìn)血管生成活性方面比VEGF及bFGF更強(qiáng)且更安全[39-40]。目前關(guān)于pUDK-HGF注射液的Ⅰ期臨床研究結(jié)果表明pUDK-HGF對肢體缺血組織血管生成有促進(jìn)作用[41]。pUDK-HGF注射液的Ⅱ期臨床研究已基本結(jié)束，結(jié)果顯示對于肢體缺血性疾病有治療作用。所以，pUDK-HGF在治療下肢缺血性疾病上不但減少細(xì)胞治療帶來的增殖、分化、突變、致瘤等風(fēng)險(xiǎn)，而且較單純的生長因子治療更有優(yōu)越性。

下肢缺血性疾病治療正從傳統(tǒng)的藥物、手術(shù)治療逐漸轉(zhuǎn)變到生物基因治療。在生物治療中干細(xì)胞有多向分化的能力并對血管形成有促進(jìn)作用[42]，但其增殖與分化機(jī)制、移植后的療效及腫瘤效應(yīng)還需進(jìn)一步探索。生長因子能夠誘導(dǎo)血管生成，也可能引發(fā)增殖性疾病、加重血管狹窄且可能合并半衰期短及有效濃度不穩(wěn)定等問題存在。通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)及質(zhì)粒載體技術(shù)解決了生長因子半衰期及有效濃度維持的問題，可促進(jìn)其應(yīng)用。干細(xì)胞移植治療及生長因子注射治療有單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用于臨床的潛力[43]，可能成為有效治療下肢缺血性疾病的新途徑。

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龍剛(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事生長因子下肢缺血性疾病移植治療?！?/p>

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.34.040

R543

A

1671-8348(2017)34-4865-03

2017-08-18

2017-09-25)