陳銳憬 綜述，史明霞 審校

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科/云南省血液病研究中心 650032)

人骨髓間充質干細胞與羊膜間充質干細胞的研究進展*

陳銳憬 綜述，史明霞△審校

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院血液科/云南省血液病研究中心 650032)

間質干細胞；人骨髓間充質干細胞；羊膜間充質干細胞

間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSC)廣泛存在于機體的各種組織器官中，例如骨髓、脂肪、羊膜、臍帶等。最初MSC是在骨髓中被發(fā)現(xiàn)的，因此骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC)被認為是干細胞的最好來源，并且用BMSC作為衡量其他組織干細胞來源的標準[1]。在其他組織來源的MSC中，羊膜間充質干細胞(amniotic mesenchymal stem cells,AMSC)因具有增殖能力強、免疫原性低和來源無倫理學爭議等特點備受專家學者們的關注，被視為BMSC的理想替代物。本文就BMSC和AMSC的生物學特性、免疫調節(jié)機制及臨床運用的潛在價值進行綜述。

1 人羊膜間充質干細胞(hAMSC)和人骨髓間充質干細胞(hBMSC)的分離、培養(yǎng)和擴增

hBMSC主要來源于骨髓，需經(jīng)有創(chuàng)操作進行采集，具有一定倫理學爭議。hBMSC常用的體內分離方法有4種：密度梯度離心法、全骨髓貼壁分離法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠分離法。其中密度梯度離心法應用最廣泛也最為經(jīng)典，此方法獲得的hBMSC純度高，增殖活性強，但操作復雜，故研究者常用簡單易行的貼壁法與此結合。最近，有學者探索使用一種BMSC過濾裝置分離純化MSC，這種濾過裝置可快速、高效、可靠地分離BMSC，避免BMSC被外界污染物污染[2]。BMSC最常用的培養(yǎng)液是含10%～20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。MSC在骨髓中的含量稀少，大約1×105～1×106個單核細胞中含有1個MSC，體外分離培養(yǎng)、擴增純化在科學研究及臨床應用當中就顯得尤為重要。研究表明，hBMSC可穩(wěn)定培養(yǎng)15代左右，而在第15代以后，細胞逐步出現(xiàn)衰老現(xiàn)象，在體外傳代培養(yǎng)20代以后，細胞生長明顯變慢，并呈現(xiàn)明顯的老化現(xiàn)象。

hAMSC是由胚胎發(fā)育過程中的胚外中胚層發(fā)育而來，是將羊膜組織剪碎用組織貼壁法或胰蛋白酶-膠原酶消化法分離得到的AMSC，采集過程對母體和新生兒不造成任何損傷，不受倫理學和臨床醫(yī)學的限制。國內外文獻報道hAMSC的分離培養(yǎng)尚無統(tǒng)一的方法，最常用的分離方法是組織塊貼壁法和胰蛋白酶-膠原酶消化法。Parolini等[3]發(fā)現(xiàn)，1 g羊膜組織理論上應該含有5×108個hAMSC。通常，1 g組織中hAMSC的產量約為1×106～2×106個。研究發(fā)現(xiàn)，hAMSC傳至3～5代后，細胞排列緊密，形態(tài)與成纖維細胞類似，以放射狀漩渦樣生長[4]。hAMSC不能夠自我分化，也不會增殖超過70代[5]。

2 hBMSC和hAMSC的生物學特性

2.1表面標志及基因表達 目前，還沒有特異性的抗原可以直接鑒定hBMSC，它不僅表達間質細胞表面抗原，還可以表達內皮細胞、上皮細胞、肌肉細胞的表面抗原，但不表達造血細胞的表面抗原[6]。BMSC可表達的主要表面抗原有黏附分子類，如CD106、CD44、CD54、CD102、CD166等；整合素家族，如CD29、CD49、CD104等；生長因子和細胞因子受體家族，如IL-1R、IL-3R、IL-4R、IL-6R、IL-7R等；干擾素受體；腫瘤壞死因子受體等，不表達CD34、CD45、CD14等造血干細胞表面標志。

hAMSC也沒有特異性的表面抗原，但隨著分選干細胞側群技術在多分化潛能干細胞中的廣泛應用，研究者們通過用流式細胞儀、聚合酶鏈反應或者免疫細胞化學染色來分析hAMSC表面抗原標志后發(fā)現(xiàn)，hAMSC可以表達間質細胞表面抗原，如CD73、CD90、CD105，也可以表達CD10、CD13、CD29、CD44、CD49c、CD49d、CD49e、CD54、CD140b、CD166、CD349、STRO-1和HLA-ABC。在使用聚合酶鏈反應檢測時，CD271和CD117(ckit)為弱表達。hAMSC不表達造血標志抗原CD34、CD45，單核細胞標志物CD14和內皮細胞標志物CD31、CD133、CD3及CD11[7]。但是Chika等[8]用流式細胞儀檢測出hAMSC可以表達造血干細胞表面標志物CD34、CD45、HLA-DR和CD14，陽性率分別為3%、17%、14%和10%。Chika等[8]還通過定量RT-PCR檢測來衡量間充質干細胞標志物，發(fā)現(xiàn)載脂蛋白D的陰性標志物在hBMSC和hAMSC中的表達都很低，但是在hAMSC中的含量還要比hBMSC低100倍；LIF和MGP都是MSC的陽性標志物，其中LIF和MGP在hBMSC中的表達率分別是AMSC的1.5倍和2 200倍，這說明BMSC和AMSC具有其各自不同的特性；他們繼續(xù)用定量RT-PCR來分析Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及Lin28基因在hBMSC和hAMSC中的表達情況，發(fā)現(xiàn)hAMSC的Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及Lin28基因表達率均要高于hBMSC，提示hAMSC的干細胞特性要比hBMSC更接近于誘發(fā)型多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)。Oct3/4是胚胎干細胞表面標志，對胚胎干細胞的增殖和多向分化具有重要作用，我國學者在研究hAMSC和hBMSC的生物學特性時發(fā)現(xiàn)，hAMSC可表達Oct3/4，而hBMSC不表達，進一步證明了hAMSC比hBMSC具有更強的干細胞特性[9]。

2.2免疫原性及免疫調節(jié)和抑制功能 hBMSC和hAMSC一樣，均只能表達低水平的MHC-Ⅰ類分子，不表達MHC-Ⅱ類分子及B7-1、B7-2、CD40、CD40L等T細胞共刺激分子，所以這兩種MSC都具有較弱的免疫原性，在組織移植中不易引起免疫排斥反應[10]。MSC可分泌轉化生長因子-β(TGF-β)、肝細胞生長因子(HGF)及PGE2等抑制T細胞的增殖、活化和防止免疫排斥反應；可產生IDO并通過色氨酸途徑抑制B細胞的增殖與活化，抑制自身免疫作用；還可通過降低自然殺傷(NK)細胞γ-干擾素(IFN-γ)的分泌參與NK細胞的免疫調節(jié)[11]。有學者將hAMSC與人或兔的外周血單核細胞以不同比例進行混合培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hAMSC可以抑制單核細胞的增殖，且當hAMSC與單核細胞的比例為1∶5時抑制效果最顯著；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測混合培養(yǎng)以后的上清液發(fā)現(xiàn)，T細胞所分泌的白細胞介素2(IL-2)和IFN-γ細胞因子的水平顯著下降，且hAMSC加入的量與IL-2和IFN-γ的分泌量呈反比[12]，說明hAMSC可通過抑制IL-2和IFN-γ細胞因子的分泌間接作用或細胞間直接接觸調節(jié)各類免疫細胞活性而發(fā)揮其免疫抑制作用，hAMSC具有低免疫原性，為其在干細胞移植治療中預防移植物抗宿主病提供了依據(jù)。因此，MSC免疫調節(jié)的研究潛力在很大程度上取決于其分泌的可以調節(jié)免疫細胞活性和影響細胞微環(huán)境的可溶性因子。隨著對MSC免疫調節(jié)性質的不斷研究，許多學者認為MSC的免疫調節(jié)特性是不成立的，MSC受到微環(huán)境中不同炎癥介質的誘導，并在不同炎癥刺激下表現(xiàn)出較高的功能可塑性，使其不僅能抑制免疫反應，也能增強免疫效應[13]。

3 hBMSC和hAMSC的臨床應用前景

hBMSC具有分化為骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞等的多向分化潛力，且易取樣分離，具有弱的免疫原性，在組織工程和臨床應用的研究當中備受青睞。最新研究表明，多種細胞因子都可促進BMSC分化為骨細胞和軟骨細胞，如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和成骨蛋白2(bone morphogenie protein 2,BMP-2)。有學者就將BMP-2/VEGF-165基因轉染后的BMSC通過關節(jié)鏡髓芯減壓移植入兔股骨頭壞死的骨髓腔中，發(fā)現(xiàn)移植4周后即有新生骨生成，移植8周后，股骨頭壞死區(qū)域的缺損骨質已基本被修復，骨質也得到了改善，骨質修復的生理期限也有所縮短。表明人BMP-2/VEGF-165基因轉染的BMSC在股骨頭壞死的臨床治療中具有可觀的療效[14]。在缺血性心臟病的研究當中，有學者構建了一種雙特異性抗體，并輔助BMSC移植入心肌纖維化小鼠體內，發(fā)現(xiàn)這種雙特異性抗體可以提高小鼠BMSC的歸巢率，顯著提高了干細胞移植治療缺血性心臟疾病的移植效率[15]。以往研究表明，增加體內Th17細胞和減少Treg細胞都可以觸發(fā)炎性疾病[16]。BMSC可以通過調節(jié)炎性細胞因子的血清水平顯示出有效的免疫抑制和抗炎作用[17-18]。有學者將IL-10通過基因工程轉染入BMSC中，再將轉染后的BMSC引入到大鼠同種異體肝移植中，發(fā)現(xiàn)移植MSCs-IL-10組的大鼠與鹽水組的大鼠相比存活時間更長，且Treg細胞相關細胞因子(IL-10和TGF-β1)和轉錄因子(FoxP3)的表達也顯著增加，同時Th17細胞相關的細胞因子(IL-17，IL-6，IFN-γ，TNF-α和IL-23)和轉錄因子(RORγt)顯著減少[19]。表明BMSC在肝臟疾病的臨床治療應用中具有重要價值。隨著hBMSC研究的不斷深入，越來越多的學者將目光從動物實驗轉向了臨床應用的研究。矽肺是一種不可逆的難以治愈的疾病，其特征是肺間質病變和肺部廣泛的結節(jié)性的纖維化。有學者為了研究hBMSC和肝細胞生長因子是否對矽肺的治療有效，將經(jīng)肝細胞生長因子轉染過的自體BMSC以每公斤體質量2×106個的細胞量靜脈輸注到患者體內，并連續(xù)輸注3周，結果發(fā)現(xiàn)患者的咳嗽、胸悶癥狀在干細胞輸注后的6個月逐漸好轉，肺功能也顯著改善，說明hBMSC的多向分化潛能和免疫調節(jié)特性在矽肺的臨床治療中具有重要研究意義[20]。在乙型肝炎相關肝硬化治療中，有學者在對患者進行自體BMSC移植的研究中發(fā)現(xiàn)，自體BMSC移植可以明顯升高血清中炎性因子TGF-β水平，高濃度TGF-β誘導的FoxP3可通過拮抗RORγt的功能來抑制Th17的分化。自體BMSC移植有望改善患者的肝功能，糾正乙型肝炎相關肝硬化患者體內Treg/Th17細胞的比例失衡，在以后的臨床治療當中擁有巨大的潛力[21]?，F(xiàn)今，自體造血干細胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation，AHSCT)已越來越多地被用于惡性血液性疾病的治療中，然而移植早期淋巴細胞復蘇率低也決定了AHSCT需要進一步優(yōu)化來提高移植效率。AHSCT的移植率取決于造血干細胞的植入和造血恢復的有效性，其在很大程度上也是由骨髓基質細胞決定的，移植前持續(xù)高劑量化療使得骨髓基質細胞嚴重受損，而BMSC的獨特的造血刺激活性可促進基質細胞再生。Batorov等[22]比較了BMSC與自身造血干細胞共移植和標準自體造血干細胞移植在治療惡性血液病患者中的療效，并且首次發(fā)現(xiàn)共移植組更能促進移植早期淋巴細胞的恢復，尤其是記憶T細胞和幼稚T細胞的恢復，能有效改善造血干細胞輸入量低或者機采淋巴細胞絕對值低患者的淋巴細胞復蘇情況。這為臨床提供了一種改善造血干細胞移植療效的新方法。

hAMSC可以分泌比hBMSC更為豐富的造血細胞因子，擁有更強的擴增能力和免疫原性低等優(yōu)勢，是組織工程再生醫(yī)學領域的重要生物材料來源。有學者將hAMSC與hBMSC共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，hAMSC不僅具有成骨分化能力，還可以促進hBMSC的增殖及分化為成骨細胞，并能促進成骨細胞的生長和堿性磷酸酶的合成，也可上調骨生成相關蛋白在成骨細胞中的表達[23]。促進間充質細胞骨再生的研究還需進一步建立動物模型實驗，更好地應用于再生醫(yī)學。最近有研究表明，hAMSC所具有的免疫特性可能被運用到自身免疫性疾病的治療當中。Shu等[24]將hAMSC注入人類類風濕關節(jié)炎大鼠模型的腹腔內，發(fā)現(xiàn)hAMSC可顯著改善大鼠關節(jié)炎的嚴重程度，降低關節(jié)炎的病理改變，同時可顯著抑制促炎細胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌。此外，hAMSC可以顯著提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和抗氧化能力，同時降低丙二醛的水平，具有抗氧化的能力。hAMSC可以減緩大鼠模型中關節(jié)炎疾病的進展，這可能是治療類風濕性關節(jié)炎的一個很有希望的細胞來源。Yamahara等[25]研究了hAMSC和人絨毛膜間充質干細胞(human chorion-derived mesenchymal stem cell,hCMSC)在細胞功能和治療性質上的差異，證實了hAMSC和hCMSC均可以分泌大量有助于促進再生作用的可溶性因子，例如各種生長因子和細胞因子，包括VEGF、胰島素樣生長因子-1、肝細胞生長因子、腎上腺髓質素和前列腺素E2(prostaglandin E2，PEG2)。發(fā)現(xiàn)hAMSC所分泌的PEG2濃度要明顯高于hCMSC，尤其是將兩種間充質干細胞與CD4+T細胞共培養(yǎng)時。他們還將兩種MSC移植入GVHD動物模型中，首次證明了hAMSC可以更好地改善急性GVHD動物模型的病理情況[25]。有研究證明，hAMSC可以顯著抑制Th1/Th7細胞的增殖和分化[26]，并通過有效抑制Th1/Th7細胞的免疫特性來緩解GVHD。因此hAMSC在防治GVHD方面有著潛在的廣闊前景。

4 展 望

綜上所述，hAMSC雖然與hBMSC具有相似的細胞形態(tài)、生長特性、細胞表型、多向分化潛能、免疫原性及免疫調節(jié)作用，但是仍存在著一定差異,hAMSC比hBMSC具有更強的增殖能力和干細胞特性,這可能與二者的來源稍有差異有關。hAMSC在羊膜中的含量要遠多于hBMSC在骨髓中的含量，且羊膜的獲取幾乎不存在倫理學爭議；hAMSC的干細胞相關基因表達水平均要高于hBMSC。但是這兩種間充質干細胞具體的差異性及哪種細胞更適合作為細胞組織工程種子細胞及用于多種疾病的細胞治療等問題，需要進一步更深入的研究。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.039

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國家自然科學基金資助項目(31260232)；云南省中青年學術技術帶頭人后備人才培養(yǎng)項目(2010CI013)；云南省科技廳昆明醫(yī)科大學應用基礎研究聯(lián)合專項基金資助項目(2012FB031)。

陳銳憬(1991-)，在讀碩士，主要從事干細胞移植及血液腫瘤方面的研究?！?/p>

，E-mail:shmxia2002@sina.com。