訾紹霞　劉愛英　張?zhí)m娟　靳旺洋　馬慧軍　程玉娟

[摘要]目的：研究紫草素對正常人表皮黑素細胞黑素合成的影響，及對紫外線輻射后黑素細胞黑素合成的影響。方法：用體外培養(yǎng)正常人表皮黑素細胞供給實驗，黑素細胞經(jīng)10mJ/cm²外線輻射后，分別以選定的幾個濃度（主要為0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L三種濃度）的紫草素培養(yǎng)72h，測定細胞增殖率、黑素含量及酪氨酸酶活性。結(jié)果：紫草素可減輕紫外線輻射對細胞增殖的抑制作用，并可抑制紫外線輻射后的表皮黑素細胞的黑素合成；較高濃度紫草素（大于0.5ug/L）對未經(jīng)照射的表皮黑素細胞的增殖有抑制作用，但對黑素合成無明顯影響。結(jié)論：紫草素可以明顯抑制紫外線輻射后表皮黑素細胞的黑素合成，推測其對紫外線輻射的黑素細胞有光保護作用。

[關(guān)鍵詞]紫草素；黑素細胞；黑素合成；酪氨酸酶；紫外線輻射；光保護

[中圖分類號]R339.3 8

[文獻標志碼]A

[文章編號]1008-6455（2017）01-0088-03

色素增加性皮膚病如黃褐斑、炎癥后色素沉著等一直是皮膚科比較常見的疾病，紫外線輻射可以加重或者誘發(fā)色素沉著發(fā)生的問題已經(jīng)越來越受到重視，隨著人們生活水平的提高，美白外用療法及對防曬產(chǎn)品的研究漸漸成為熱點。紫草含具有多種生物活性的有效成分，主要包括萘醌類化合物左旋紫草素及其衍生物，其有抗炎作用，抗病原微生物作用，抗癌作用，抗生育作用，抗氧化作用等。姜愛莉等人則報道了紫草中的抗氧化化學成分，發(fā)現(xiàn)其有很強的抗氧化活性，是一種有開發(fā)前途的抗氧化劑。作為一種強抗氧化劑，紫草對黑素細胞的光保護作用，目前卻沒有相關(guān)的報道，筆者基于此，進行了以下相關(guān)研究。

1.材料和方法

1.1材料：二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶、分離酶（dispase）、MCDBl53培養(yǎng)基、四甲基偶氮唑藍（MTT）均購自Sigma公司；小牛血清、胎牛血清、1640培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、左旋多巴、TritonX 100購自Hyclone公司；細胞因子（NGF，F(xiàn)GF，ET1）購自Sino Biological公司；紫草素由中國人民解放軍309醫(yī)院皮膚科惠贈；以DMSO配制成50ug/L的貯存液，-80°C冰箱保存，使用前稀釋至工作濃度。25cm²塑料培養(yǎng)瓶，96孔培養(yǎng)板為美國Corning公司產(chǎn)品；GS-2004日光模擬器（北京澳華公司），紫外分光光度計（上海精密分析儀器有限公司），光輻照度計量儀SUV 5（中國計量科學院）；Therm0371型二氧化碳培養(yǎng)箱，Eppendorf微量移液器，Leica倒置顯微鏡，無菌工作臺等。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)：取泌尿外科包皮環(huán)切術(shù)后的分離體做標本，碘伏浸泡15min，PBS沖洗3遍，眼科剪去除皮下脂肪組織及微小血管，將組織剪成1cm×1cm的小塊，加入0.5%分離酶至液體完全覆蓋組織，放置4℃過夜使真皮表皮充分分離，眼科鑷小心分離表真皮，將表皮置于0.25%的胰酶中37℃消化5～10min，顯微鏡觀察消化情況良好后加入3～5ml含新生牛血清的1640培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞懸液，使細胞分散，200目濾網(wǎng)過濾，2000rpm離心5min，棄掉上清液后加入配制好的黑素細胞培養(yǎng)基，吹打使細胞懸浮，計數(shù)并調(diào)節(jié)合適的細胞濃度，接種到25cm²的培養(yǎng)瓶中（接種密度為10⁵個細胞/cm²），常規(guī)培養(yǎng)換液，細胞生長至80%融合時傳代，取傳代2代～3代純化的黑素細胞用于實驗。細胞接種24h后，根據(jù)實驗分組對細胞進行干預(yù)處理。

黑素細胞的鑒定：采取HMB45單抗免疫組化和FontanaMasson染色方法對黑素細胞進行鑒定。

1.2.2紫外線照射：GS-2004日光模擬器能夠模擬自然紫外線照射，根據(jù)文獻選定紫外線照射劑量為10mJ/cm²，照射強度為1mw/cm²，光源距離培養(yǎng)板20cm垂直照射，照射前將培養(yǎng)基換為0.1M滅菌的PBS，照射后換回相應(yīng)的培養(yǎng)基。

1.2.3藥物配制和實驗分組：使用DMSO配制紫草素母液，濃度為50ug/L，-80℃保存，用前再用新鮮培養(yǎng)基調(diào)至終濃度。經(jīng)預(yù)實驗選用紫草素的終濃度為0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L。

實驗分組分別為空白對照組（僅加入等量相應(yīng)溶媒）、紫草素組（濃度分別為0.25ug/L、0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L）、紫外線輻射組、紫外線輻射+紫草素組（0.25ug/L、0.5ug/L 2個濃度）、陽性對照組（紫外線輻射+20ug/ml維生素c）。每一處理組分別作用細胞72h。

1.2.4MTT法測定細胞增殖率：用酶標儀測定吸光度A490nm值。細胞增值率以處理組A490/空白對照組A490的百分率來表示。

1.2.5黑素含量測定：NaOH裂解法測黑素含量，參照文獻的方法稍做改良，用分光光度計測定黑素的吸光度（A470nm）。黑素含量以（處理組A470/細胞數(shù)）/（空白對照組A470/細胞數(shù)）×100來表示。每一實驗重復(fù)4次。

1.2.6酪氨酸酶活性測定：參照文獻采用多巴氧化法，分光光度計測定黑素的吸光度值（A475nm）。酪氨酸酶活性以（處理組A475值/細胞數(shù)）/（空白對照組A475值/細胞數(shù)）×100來表示。每一實驗重復(fù)4次。

1.2.7數(shù)據(jù)處理：各組數(shù)據(jù)用x±s表示。采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行組問單因素方差分析，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2.結(jié)果

2.1對黑素細胞增殖率的影響：與空白對照組相比，紫草素濃度為0.25ug/L時，對黑素細胞的增殖沒有影響（P>0.05），紫草素濃度在0.5ug/L、1ug/L、2.5ug/L、5ug/L時對黑素細胞增殖率隨著濃度的增加而下降并有統(tǒng)計學差異（P<0.05）（圖1）；紫外線（10mJ/cm²）照射后細胞增殖率降低（P<0.05），紫外線照射+紫草素組（濃度為0.25ug/L、0.5ug/L）與照射組相比，細胞增殖有明顯增加（P<0.05）。

2.2對黑素含量的影響：根據(jù)上述對黑素細胞增值率的影響結(jié)果及有關(guān)文獻。的報道，我們選擇了0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L三種濃度的紫草素來進行實驗，結(jié)果顯示：與空白對照組相比較，上述三種濃度的紫草素對黑素含量無影響（P>0.05）；紫外線照射可以明顯增加黑素含量（P<0.05），但紫外線輻射+紫草素（0.25ug/L，0.5ug/L）后，與單純紫外線輻射組相比較，黑素含量有所下降，統(tǒng)計學結(jié)果顯示有顯著差異（P<0.05）（圖2）。20ug/mL維生素c也有一定程度抑制紫外線輻射后黑素細胞黑素合成增加的作用，但與紫外線輻射組比較無明顯差異（P>0.05）。

2.3對酪氨酸酶活性的影響：紫草素組（0.25ug/L，0.5ug/L，1ug/L）與對照組比較，其對黑素細胞的酪氨酸酶活性無影響（P>0.05），紫外線照射可明顯增加酪氨酸酶活性（P<0.05）。與紫外線輻射組比較，加0.25ug/L紫草素和0.5ug/L紫草素組可明顯降低細胞內(nèi)酪氨酸酶活性（P<0.05）；20ug/ml維生素c組對紫外線輻射后細胞內(nèi)酪氨酸酶活性無明顯影響（P>0.05）（見圖3）。

3.討論

紫草的有效成分主要有以下兩大類：一類是脂溶性的萘醌類色素，包括紫草素（sh ikonin），乙酰紫草素（acetylshikonin），β，β二甲基丙烯酰紫草素（i sobuthyl2shikonin），β羥基異戊酰紫草素（β-hydaroxyi sovalerylshikonin），異戊酰紫草素（isovaleryl shikonin），去氧紫草素（deoxy shikonin）等；另一類是水溶性的多糖成分，含量在2%左右。萘醌類色素的主要藥理作用除了抗炎作用、抗病原微生物作用、抗癌作用、抗生育作用、保肝作用以外，還有抗凝血、抗免疫缺陷、抗前列腺素合成、抗真菌以及清除活性氧作用等。

本試驗結(jié)果提示：紫草素在對黑素細胞增殖率影響不大（>83%）的濃度下（0.25ug/L、0.5ug/L）可以明顯抑制經(jīng)紫外線輻射后的黑素細胞的黑素合成，但對正常黑素細胞的黑素合成無影響。這與以前的相關(guān)研究有差異，筆者分析這可能與選擇培養(yǎng)的細胞株不同有關(guān)，也與培養(yǎng)細胞的所處狀態(tài)不同有關(guān)，共培養(yǎng)體系中的黑素細胞與純化的單一黑素細胞對紫草素的反應(yīng)是可以不同的，因為角質(zhì)形成細胞可以通過分泌細胞因子來調(diào)節(jié)黑素細胞的功能。在以前的研究中，王威，劉婷等表明，紫草素以及紫草多糖都具有一定的抗氧化活性。其中紫草素的抗氧化能力相當于維生素c的35.5%，其抗氧化作用主要由于其醌結(jié)構(gòu)中在5位和8位上具有對應(yīng)酚羥基決定的。基于此，我們推測紫草素對紫外線輻射后的黑素細胞會有保護作用并設(shè)計了本研究，實驗結(jié)果證實了在不影響黑素細胞增殖率的濃度下（0.25ug/L）及影響不大的濃度下（0.5ug/L），紫草素可以明顯地抑制紫外線輻射后黑素細胞的黑素合成及酪氨酸酶活性，其光保護作用得到了證實。另有研究表明，復(fù)方紫草油外用于燒傷創(chuàng)面可以使局部ET-1和NO釋放減少，兩者比例更趨于協(xié)調(diào)，從而使創(chuàng)面微血管的收縮痙攣狀態(tài)減輕，組織缺血狀態(tài)得到緩解，自由基生成減少，最后達到抗炎的效果。而且早有實驗證實活性氧自由基（ROs）與一氧化氮（NO）均具有很強的刺激黑素細胞黑素合成作用，紫外線輻射可誘導(dǎo)二者的產(chǎn)生，這也是紫外線促進黑素合成的重要原因之一。因此我們推測紫草素可能通過抑制上述物質(zhì)的產(chǎn)生來發(fā)揮其光保護作用，這值得我們進一步探討和研究。