史 亮， 陳良安

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016；2.解放軍總醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853

·綜 述·

肺組織再生研究進展

史 亮1,2， 陳良安2

1.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科，遼寧 沈陽 110016；2.解放軍總醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853

肺組織再生； 組織工程； 肝細(xì)胞因子； 角質(zhì)細(xì)胞生長因子； 間充質(zhì)干細(xì)胞

Lung tissue regeneration; Tissue engineering; Hepatocyte growth factor; Keratinocyte growth factor; Mesenchymal stem cell

肺部疾病是人類最常見的疾病之一，其發(fā)病率及病死率均較高。慢性肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺間質(zhì)纖維化等，目前，在其終末期行肺移植是有效的治療方法[1]。但由于供體數(shù)量不能滿足需求，術(shù)后需要免疫抑制治療，以及存在慢性排斥、潛在疾病傳播等原因，肺移植手術(shù)的開展受到很大的限制。利用機體本身的再生能力或者應(yīng)用藥物等手段激活機體的再生潛力是許多疾病治療的理想方法。近年來，再生醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一，應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建組織工程肺來替代移植肺組織已經(jīng)成為治療的新選擇和研究方向[2]。雖然肺復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)以及多種細(xì)胞組成的特點使其在再生醫(yī)學(xué)研究方面處于相對落后的狀態(tài)，但其發(fā)展前景仍然令人期待。筆者就肺組織再生以及肺組織工程研究的進展進行綜述。

1 可促進肺組織再生的物質(zhì)

1.1 肝細(xì)胞因子 肝細(xì)胞因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一種多能生長因子。有研究表明，在肺發(fā)育過程中以及肺損傷后HGF通過其受體c-Met的絡(luò)氨酸激酶磷?；l(fā)揮其促有絲分裂、促成形及肺保護作用[3-4]。體內(nèi)及體外研究均表明，HGF是肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞有效的促分裂原[5-6]。HGF在肺再生中的作用也進行了廣泛的研究。腹腔應(yīng)用HGF可以明顯增加小鼠外周血單核細(xì)胞中Sca-1+/Flk-1+細(xì)胞的比例，同時可以促進肺泡壁中骨髓來源及肺泡壁本身存在的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，從而逆轉(zhuǎn)彈性蛋白酶引起的小鼠肺氣腫改變[7]。Shigemura等[8]通過轉(zhuǎn)染HGF基因的方法研究HGF在大鼠肺氣腫中的作用，發(fā)現(xiàn)其可以廣泛增強肺血管的生成、抑制肺泡壁細(xì)胞的凋亡。相似的研究通過靜脈注射具有分泌HGF的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有改善大鼠肺氣腫的作用[9]。Hegab等[10]通過鼻腔給藥治療彈性蛋白引起的小鼠肺氣腫，發(fā)現(xiàn)HGF可以減輕由彈性蛋白導(dǎo)致的氣腔擴大以及肺泡壁的破壞，同時可以將靜態(tài)肺順應(yīng)性提高到正常水平。目前的研究已經(jīng)證實，HGF具有促進肺再生的作用，但仍需要臨床研究進行進一步驗證。

1.2 角質(zhì)細(xì)胞生長因子 角質(zhì)細(xì)胞生長因子(keratinocyte growth factor，KGF)又稱成纖維細(xì)胞生長因子7(Fibroblast growth factor 7，F(xiàn)GF7)，在傷口愈合過程中存在一種生長因子，可以促進角質(zhì)細(xì)胞生長、傷口的修復(fù)與愈合。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AEⅡ)表達KGF受體。有研究發(fā)現(xiàn)，KGF可以促進AEⅡ的增殖、移行以及存活[11-12]。KGF是否具有肺泡損傷的修復(fù)作用存在爭議。應(yīng)用KGF可以預(yù)防小鼠由彈性蛋白酶誘導(dǎo)的肺氣腫，但是彈性蛋白酶應(yīng)用3周后再應(yīng)用KGF并不能逆轉(zhuǎn)肺泡的破壞[13]。這提示KGF在抗炎方面的作用更突出。

1.3 粒細(xì)胞集落刺激因子 粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)也稱集落刺激因子3(colony stimulating factor 3,CSF3)，是一種糖蛋白，可以由多種組織產(chǎn)生，刺激骨髓產(chǎn)生粒細(xì)胞和干細(xì)胞，并釋放入血。G-CSF也具有促進組織再生的作用。有研究證實，小鼠心肌壞死后G-CSF可以促進骨髓干細(xì)胞釋放入血，并最終分化為心肌細(xì)胞，起到促進組織再生的作用[14]。Ishizawa等[15]發(fā)現(xiàn)，單獨應(yīng)用G-CSF治療小鼠肺氣腫可以減輕肺氣腫的程度。該研究單獨應(yīng)用G-CSF或視黃酸(retinoic acid，RA)均可以減輕小鼠肺氣腫的程度，聯(lián)合應(yīng)用則可以產(chǎn)生疊加作用。G-CSF增加循環(huán)骨髓源性祖細(xì)胞是其發(fā)揮再生作用的主要機制。

1.4 腎上腺髓質(zhì)素 腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)最初分離于腎上腺髓質(zhì)腫瘤的嗜鉻細(xì)胞瘤，是一種多功能調(diào)節(jié)肽，包括誘導(dǎo)cAMP的產(chǎn)生，擴張支氣管，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、抑制凋亡、血管形成以及具有抗微生物活性等。氣道上皮基底細(xì)胞以及肺泡Ⅱ上皮細(xì)胞均分布有豐富的ADM受體[16]。認(rèn)為ADM可能參與肺組織再生。Murakami等[17]給彈性蛋白酶誘導(dǎo)的小鼠肺氣腫持續(xù)應(yīng)用ADM后，可以明顯增加外周血Sca-1+細(xì)胞，同時使肺泡及血管再生。這提示ADM可以動員骨髓源性細(xì)胞入血，同時對肺泡上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞具有直接的保護作用。

1.5 RA RA參與肺的生長發(fā)育，尤其在肺泡形成方面發(fā)揮作用[18]。敲除RA受體基因的小鼠可以導(dǎo)致其肺泡形成障礙，包括正常肺泡及彈性纖維的形成[19]。Liu等[20]發(fā)現(xiàn)，RA可以增加大鼠新生胎兒肺成纖維細(xì)胞彈力蛋白的合成，提示RA是肺泡形成過程中彈性蛋白合成的潛在的調(diào)節(jié)物質(zhì)。Massaro等[21]研究發(fā)現(xiàn)，全反式視黃酸(all trans retinoic acid,ATRA)對彈性蛋白酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的大鼠肺氣腫具有逆轉(zhuǎn)作用。但是研究中選用的動物、RA劑量的不同可能是研究結(jié)果出現(xiàn)分歧甚至矛盾的原因。RA在臨床研究中的應(yīng)用并未得出有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果，包括肺功能以及肺部CT的改善等[22-23]。

1.6 他汀類藥物 他汀類藥物是3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A醛糖還原酶抑制劑，除具有降低膽固醇的作用外，還具有多種藥學(xué)功能，如抗炎、改善內(nèi)皮細(xì)胞功能等。同時，有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物在組織再生方面也有作用[24]。彈性蛋白酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的肺氣腫小鼠腹腔應(yīng)用辛伐他汀后，肺部病理顯示平均線性截距明顯減小、PCNA+明顯增加[25]。

2 參與肺組織再生與修復(fù)功能的細(xì)胞

2.1 外源性祖細(xì)胞 骨髓是外源性祖細(xì)胞的主要來源。細(xì)菌性肺炎以及急性肺損傷患者，其循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量增加，并且增加的程度與臨床預(yù)后呈正相關(guān)[26-27]。這說明，炎癥介質(zhì)刺激后，骨髓源性的祖細(xì)胞釋放入血，而這些細(xì)胞參與了炎癥過程的識別和修復(fù)。應(yīng)用彈性蛋白酶誘導(dǎo)的小鼠肺氣腫動物模型進行的肺再生研究中，進一步說明了骨髓源性祖細(xì)胞的作用。其中，應(yīng)用G-CSF、HGF等具有促進肺組織再生的物質(zhì)治療肺氣腫小鼠，發(fā)現(xiàn)在肺泡壁血管內(nèi)骨髓源性內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量增高，并且治療后骨髓源性細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。這是分化為肺泡細(xì)胞還是僅僅對原有細(xì)胞的補充，目前骨髓源性細(xì)胞的具體作用方式仍不明確。

2.2 內(nèi)源性祖細(xì)胞

2.2.1 肺泡上皮祖細(xì)胞 肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞被認(rèn)為是肺部干細(xì)胞之一，可以增殖并認(rèn)為可以轉(zhuǎn)化為肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞。急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory ditress syndrome,ALI/ARDS)時肺泡上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、壞死，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的肺泡破壞，肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在ALI/ARDS恢復(fù)期可以明顯增生。ALI/ARDS時肺泡Ⅱ型細(xì)胞亦可能受損破壞，這時骨髓源性祖細(xì)胞及肺部潛在存在的內(nèi)源性干細(xì)胞將發(fā)揮修復(fù)作用。應(yīng)用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)嵌合體小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，肺泡再生過程中包括骨髓源性細(xì)胞(GFP陽性)和非骨髓源性細(xì)胞(GFP陰性)[15]。這說明肺本身存在具有修復(fù)能力細(xì)胞。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞能夠修復(fù)受損肺泡上皮，但是肺自身是否存在能夠修復(fù)受損肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的內(nèi)源性干細(xì)胞仍不確定。有研究認(rèn)為，小鼠Sca-1+細(xì)胞是其肺內(nèi)源性干細(xì)胞[28-29]。大多數(shù)Sca-1+細(xì)胞是肺內(nèi)源性干細(xì)胞，而c-kit+細(xì)胞是骨髓源性細(xì)胞[10]。

2.2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞 許多器官存在自身的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。MSCs具有自我更新的能力，同時可以分化為間充質(zhì)細(xì)胞。目前，MSCs的識別缺乏特異性細(xì)胞表面標(biāo)志。判斷MSCs的標(biāo)準(zhǔn)[30]：(1)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下呈貼壁生長；(2)細(xì)胞表面標(biāo)志物表現(xiàn)為CD105、CD73、CD90陽性，而CD45、CD34、CD14或CD11b陰性；(3)體外可誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞。肺組織中存在MSCs，新生兒的肺臟、支氣管肺泡盥洗液均可以分離出MSCs[31-32]。Karoubi等[33]成功從人肺組織中分離出MSCs，并分化出表達水通道蛋白5及Clara細(xì)胞分泌蛋白(Clara cell secretory protein,CCSP)的肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞。有研究已經(jīng)對MSCs在肺損傷的修復(fù)作用方面進行了評估，但是MSCs在肺組織再生中的作用尚不明確。MSCs可以產(chǎn)生許多細(xì)胞因子和生長因子。目前，MSCs在肺損傷修復(fù)方面的作用主要是抗炎效應(yīng)及免疫調(diào)節(jié)，其直接分化為肺組織細(xì)胞的作用處于次要地位[34]。

3 組織工程肺

肺組織具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)、包含30多種細(xì)胞類型。近年來，隨著干細(xì)胞研究的進展，呼吸系統(tǒng)再生醫(yī)學(xué)，尤其肺組織工程方面取得了很大的進步。復(fù)雜的細(xì)胞源、支架以及培養(yǎng)環(huán)境是組織工程肺構(gòu)建的關(guān)鍵因素。有學(xué)者首次通過體外3D培養(yǎng)大鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞成功構(gòu)建肺泡樣結(jié)構(gòu)(alveolar-like structure)[35]。Chen等[36]以胎鼠細(xì)胞為種子細(xì)胞，膠原-糖胺聚糖為組織工程支架，于體外形成肺組織結(jié)構(gòu)，使膠原-糖胺聚糖作為肺組織工程細(xì)胞支架成為可能的選擇之一。目前，應(yīng)用于肺組織工程的細(xì)胞源包括成體肺祖細(xì)胞、支氣管-肺泡干細(xì)胞、Clara細(xì)胞、肺泡上皮干細(xì)胞以及新生肺組織和胚胎干細(xì)胞等。Andrade等[37]將胎鼠細(xì)胞與海綿明膠混合后注入到成體大鼠肺內(nèi)，標(biāo)記的胎鼠細(xì)胞可存活35 d，同時在海綿明膠與大鼠肺組織交界處可以形成肺泡樣結(jié)構(gòu)，并觀察到海綿明膠內(nèi)有新生血管形成。從體外到體內(nèi)的研究突破，肺組織工程隨著新興材料的發(fā)現(xiàn)和發(fā)明也不斷進步。細(xì)胞支架的選擇包括良好的組織相容性、適宜的可降解性、適合種子細(xì)胞生長的物理特性等。去細(xì)胞化支架由于保留了較完整的細(xì)胞外基質(zhì)，已成為肺組織工程研究的熱門方向。

隨著干細(xì)胞科學(xué)以及大量動物研究的進行，肺組織再生及修復(fù)已經(jīng)取得了很大的進展。雖然相對于皮膚、血管及整形科學(xué)，肺組織再生及組織工程方面仍較落后，但對于難治性的肺部疾病仍然是令人期待的治療方法之一。

[1] Tavana S,Mirzaei S.The Effect of Renal Transplantation on Respiratory Muscle Strength in Patients with End Stage Renal Disease[J].Tanaffos,2016,15(2):83-88.

[2] Chistiakov DA.Endogenous and exogenous stem cells:a role in lung repair and use in airway tissue engineering and transplantation[J].J Biomed Sci,2010,17:92.

[3] Ohmichi H,Koshimizu U,Matsumoto K,et al.Hepatocyte growth factor (HGF) acts as a mesenchyme-derived morphogenic factor during fetal lung development[J].Development,1998,125(7):1315-1324.

[4] Ohmichi H,Matsumoto K,Nakamura T.In vivo mitogenic action of HGF on lung epithelial cells:pulmotrophic role in lung regeneration[J].Am J Physiol,1996,270(6 Pt 1):L1031-L1039.

[5] Ito Y,Correll K,Schiel JA,et al.Lung fibroblasts accelerate wound closure in human alveolar epithelial cells through hepatocyte growth factor/c-Met signaling[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2014,307(1):L94-L105.

[6] Gazdhar A,Temuri A,Knudsen L,et al.Targeted gene transfer of hepatocyte growth factor to alveolar type II epithelial cells reduces lung fibrosis in rats[J].Hum Gene Ther,2013,24(1):105-116.

[7] Ishizawa K,Kubo H,Yamada M,et al.Hepatocyte growth factor induces angiogenesis in injured lungs through mobilizing endothelial progenitor cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,324(1):276-280.

[8] Shigemura N,Sawa Y,Mizuno S,et al.Amelioration of pulmonary emphysema by in vivo gene transfection with hepatocyte growth factor in rats[J].Circulation,2005,111(11):1407-1414.

[9] Shigemura N,Okumura M,Mizuno S,et al.Autologous transplantation of adipose tissue-derived stromal cells ameliorates pulmonary emphysema[J].Am J Transplant,2006,6(11):2592-2600.

[10] Hegab AE,Kubo H,Yamaya M,et al.Intranasal HGF administration ameliorates the physiologic and morphologic changes in lung emphysema[J].Mol Ther,2008,16(8):1417-1426.

[11] Ulich TR,Yi ES,Longmuir K,et al.Keratinocyte growth factor is a growth factor for type II pneumocytes in vivo[J].J Clin Invest,1994,93(3):1298-1306.

[12] King G,Smith ME,Cake MH,et al.What is the identity of fibroblast-pneumocyte factor[J].Pediatr Res,2016,80(6):768-776.

[13] Plantier L,Marchand-Adam S,Antico Arciuch VG,et al.Keratinocyte growth factor protects against elastase-induced pulmonary emphysema in mice[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,293(5):L1230-L1239.

[14] Fukuhara S,Tomita S,Nakatani T,et al.G-CSF promotes bone marrow cells to migrate into infarcted mice heart, and differentiate into cardiomyocytes[J].Cell Transplant,2004,13(7-8):741-748.

[15] Ishizawa K,Kubo H,Yamada M,et al.Bone marrow-derived cells contribute to lung regeneration after elastase-induced pulmonary emphysema[J].FEBS Lett,2004,556(1-3):249-252.

[16] Kapoor S.Prohibitin and its rapidly emerging role as a biomarker of systemic malignancies[J].Hum Pathol,2013,44(4):678-679.

[17] Murakami S,Nagaya N,Itoh T,et al.Adrenomedullin regenerates alveoli and vasculature in elastase-induced pulmonary emphysema in mice[J].Am J Respir Crit Care Med,2005,172(5):581-589.

[18] Peterlin P,Garnier A,Tissot A,et al.Successful treatment of acute promyelocytic leukemia with arsenic trioxide and all-trans retinoic acid in a double lung and kidney transplanted patient[J].Ann Hematol,2016,95(10):1737-1738.

[19] McGowan S,Jackson SK,Jenkins-Moore M,et al.Mice bearing deletions of retinoic acid receptors demonstrate reduced lung elastin and alveolar numbers[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2000,23(2):162-167.

[20] Liu B,Harvey CS,McGowan SE.Retinoic acid increases elastin in neonatal rat lung fibroblast cultures[J].Am J Physiol,1993,265(5 Pt 1):L430-L437.

[21] Massaro GD,Massaro D.Retinoic acid treatment abrogates elastase-induced pulmonary emphysema in rats[J].Nat Med,1997,3(6):675-677.

[22] Mao JT,Goldin JG,Dermand J,et al.A pilot study of all-trans-retinoic acid for the treatment of human emphysema[J].Am J Respir Crit Care Med,2002,165(5):718-723.

[23] Stolk J,Stockley RA,Stoel BC,et al.Randomised controlled trial for emphysema with a selective agonist of the γ-type retinoic acid receptor[J].Eur Respir J,2012,40(2):306-312.

[24] Brittain SB,Gohil SV,Nair LS.Statins as bioactive molecules to support bone regeneration[J].Curr Med Chem,2014,21(25):2980-2988.

[25] Takahashi S,Nakamura H,Seki M,et al.Reversal of elastase-induced pulmonary emphysema and promotion of alveolar epithelial cell proliferation by simvastatin in mice[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2008,294(5):L882-L890.

[26] Yamada M,Kubo H,Ishizawa K,et al.Increased circulating endothelial progenitor cells in patients with bacterial pneumonia: evidence that bone marrow derived cells contribute to lung repair[J].Thorax,2005,60(5):410-413.

[27] Burnham EL,Taylor WR,Quyyumi AA,et al.Increased circulating endothelial progenitor cells are associated with survival in acute lung injury[J].Am J Respir Crit Care Med,2005,172(7):854-860.

[28] Liu HM,Ma LJ,Wu JZ,et al.MSCs relieve lung injury of COPD mice through promoting proliferation of endogenous lung stem cells[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2015,35(6):828-833.

[29] Hegab AE,Kubo H,Fujino N,et al.Isolation and characterization of murine multipotent lung stem cells[J].Stem Cells Dev,2010,19(4):523-536.

[30] Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement[J].Cytotherapy,2006,8(4):315-317.

[31] Pedrazza L,Cunha AA,Luft C,et al.Mesenchymal stem cells improves survival in LPS-induced acute lung injury acting through inhibition of NETs formation[J].J Cell Physiol,2017.[Epub ahead of print]

[32] Sinclair K,Yerkovich ST,Chambers DC.Mesenchymal stem cells and the lung[J].Respirology,2013,18(3):397-411.

[33] Karoubi G,Cortes-Dericks L,Breyer I,et al.Identification of mesenchymal stromal cells in human lung parenchyma capable of differentiating into aquaporin 5-expressing cells[J].Lab Invest,2009,89(10):1100-1114.

[34] Wong SP,Rowley JE,Redpath AN,et al.Pericytes, mesenchymal stem cells and their contributions to tissue repair[J].Pharmacol Ther,2015,151:107-120.

[35] Sugihara H,Toda S,Miyabara S,et al.Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture[J].Am J Pathol,1993,142(3):783-792.

[36] Chen P,Marsilio E,Goldstein RH,et al.Formation of lung alveolar-like structures in collagen-glycosaminoglycan scaffolds in vitro[J].Tissue Eng,2005,11(9-10):1436-1448.

[37] Andrade CF,Wong AP,Waddell TK,et al.Cell-based tissue engineering for lung regeneration[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2007,292(2):L510-L518.

史 亮(1975-)，男，遼寧開原人，副主任醫(yī)師，碩士

2095-5561(2017)01-0058-04 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.01.16

2016-12-19