岳鑒穎，王金枝，張春暉，杜桂紅，許雄

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提取時間對雞骨蛋白凝膠特性和蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

岳鑒穎1，王金枝1，張春暉1，杜桂紅2，許雄2

（1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100193；2鶴壁普樂泰生物科技有限公司，河南鶴壁 456750）

【目的】研究提取時間對雞骨蛋白（chicken bone protein，CBP）凝膠特性的影響，為利用雞骨副產(chǎn)物制備食用凝膠提供參考?！痉椒ā坎捎脽釅撼樘岱ㄌ崛BP，于4℃孵育制備CBP凝膠，測定不同抽提時間的抽提液中總固形物、粗蛋白、羥脯氨酸含量、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)、分子量分布的變化，探討抽提時間對CBP凝膠色差、凝膠強(qiáng)度的影響，并分析各指標(biāo)之間的相關(guān)性。【結(jié)果】抽提時間顯著影響雞骨蛋白的提取率（＜0.05），導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化進(jìn)而影響其凝膠特性。抽提時間從0—120 min，抽提液中總固形物、粗蛋白和羥脯氨酸含量均顯著增加（＜0.05）；隨著提取時間延長（40—120 min），蛋白發(fā)生顯著降解，分子量10—30 kDa的肽段從40 min的59.82%降低到120 min的13.99%，分子量＜10 kDa的肽段從40 min的35.46% 升高到120 min的86.01%；提取時間延長引起蛋白發(fā)生部分程度變性，導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)改變，0—40 min時的CBP酰胺Ⅰ帶由100%的α-螺旋組成，60—90 min時出現(xiàn)9.9%—17.6%的β-折疊結(jié)構(gòu)，120 min時β-折疊全部降解；對CBP凝膠特性的分析表明，抽提時間為0 min時，雞骨蛋白不形成凝膠，而抽提20、40和60 min時的凝膠強(qiáng)度無顯著性差異，均優(yōu)于90、120 min組；隨著提取時間延長（20—120 min），提取液的透明度顯著增加（＜0.05），但40和60 min組的CBP制備的凝膠色澤最佳（＜0.05）；抽提時間（20—120 min）對凝膠持水性無顯著影響（＞0.05）。相關(guān)性分析表明，CBP中羥脯氨酸含量、CBP降解程度與凝膠特性顯著相關(guān)（＜0.05）?！窘Y(jié)論】熱壓抽提時間對CBP凝膠特性有顯著影響，綜合考慮蛋白得率、凝膠色澤、強(qiáng)度等因素，40和60 min提取的雞骨蛋白較適合制備凝膠。

雞骨蛋白；熱壓抽提法；提取時間；凝膠特性；二級結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】2015年中國肉雞產(chǎn)量約為1.3×107t[1]，肉雞屠宰分割產(chǎn)生的雞骨架約占雞肉的25%— 30%，達(dá)到3.25×106—3.9×106t[2]。研究表明，雞骨是一種優(yōu)質(zhì)蛋白資源，其蛋白質(zhì)含量約為19%，其中膠原蛋白占總蛋白的35%—40%[2]。但目前雞骨利用方式單一，主要用于加工骨糊、骨粉等低附加值產(chǎn)品[3]，而骨蛋白類高附加值產(chǎn)品較少，因此，開發(fā)雞骨原料的高值化利用技術(shù)，對于培育雞肉加工行業(yè)新的效益增長點(diǎn)具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】動物的皮、骨中富含膠原蛋白，后者的部分水解產(chǎn)物可以形成食用凝膠[4]。由于膠原蛋白凝膠具有良好的生物相容性和功能特性，廣泛應(yīng)用于灌湯包子、餃子、肉糜型肉品以及甜點(diǎn)、乳品等食品加工，用于提高營養(yǎng)品質(zhì)、改善組織結(jié)構(gòu)和口感，且需求量逐年增加，造成市場供不應(yīng)求[5]。目前，制備凝膠的膠原蛋白主要來源于豬皮、牛皮、魚皮等[4-6]，由于骨源食品加工技術(shù)匱乏，以可食性動物骨作為凝膠蛋白來源的研究較少。膠原蛋白制備傳統(tǒng)方法多采用酸堿工藝，包括原料粉碎、去除非膠原蛋白、脫脂、酸/堿提取、透析、凍干等步驟，工藝復(fù)雜、耗時長，加工過程中大量使用酸、堿，且耗水耗能，易造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[7]。目前已有很多關(guān)于膠原蛋白提取和凝膠制備工藝優(yōu)化的報道。CHEN等[5]采用超高壓輔助HCl提取膠原蛋白并制備凝膠，凝膠強(qiáng)度顯著提高。WANG等[6]采用胃蛋白酶輔助HCl提取膠原蛋白，提取率顯著提高。經(jīng)過工藝優(yōu)化，膠原蛋白的提取率和凝膠強(qiáng)度等有所提高，但是傳統(tǒng)制備工藝耗時長，大量使用酸、堿等問題仍未得到解決?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，筆者實(shí)驗室以可食性骨為原料，創(chuàng)新性地開發(fā)出骨蛋白熱壓抽提方法，即利用熱壓抽提罐在高溫高壓條件下使雞骨蛋白快速溶出，優(yōu)化了骨蛋白制備工藝，克服傳統(tǒng)方法的不足。前期對雞骨蛋白高效提取研究發(fā)現(xiàn)，熱壓抽提可以有效地促進(jìn)骨蛋白的遷移與溶出，總蛋白提取率達(dá)83.51%，膠原蛋白的提取率達(dá)96.81%[8]。熱壓抽提導(dǎo)致骨蛋白不同程度的降解，誘導(dǎo)膠原蛋白三股螺旋解離，優(yōu)化并生產(chǎn)驗證了130℃提取90 min可以兼顧雞骨蛋白提取率和產(chǎn)品品質(zhì)[9-10]，但是熱提取時間越長，蛋白水解程度越高，凝膠強(qiáng)度越差[11]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以雞骨為研究對象，采用熱壓抽提的方法在最佳提取溫度（130℃）下制備雞骨蛋白，動態(tài)分析不同抽提時間下雞骨蛋白的二級結(jié)構(gòu)、分子量分布、凝膠強(qiáng)度、色澤等指標(biāo)的變化，闡明抽提時間對雞骨蛋白理化特性和凝膠特性的作用效應(yīng)，優(yōu)化抽提時間，為骨蛋白用于食用凝膠生產(chǎn)提供工藝參考。

1 材料與方法

試驗于2015年7—12月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所肉品實(shí)驗室進(jìn)行。

1.1 試驗材料

雞骨架，購于河南鶴壁普勒泰生物科技有限公司，保存于-18℃冰箱中。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主要試劑 羥脯氨酸標(biāo)品、一水檸檬酸、氫氧化鈉、無水乙酸鈉、濃鹽酸、對二甲氨基苯甲醛、氯胺T、濃硫酸等試劑，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞色素C（12.5 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）、桿菌肽（1.45 kDa）、乙氨酰氨-乙氨酰氨-精氨酸（451 Da）和乙氨酰氨-乙氨酰氨-乙氨酸（189 Da）標(biāo)準(zhǔn)品，美國Sigma化學(xué)試劑公司。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 PG-150破骨機(jī)，廊坊市頂天輕工機(jī)械有限公司；高溫高壓提取罐，浙江天聯(lián)機(jī)械有限公司；MASTER-53M手持式折射儀，日本愛宕有限公司；T6-新世紀(jì)紫外分光光度計，北京普希通用儀器有限公司；KJELTEC2300型全自動凱氏定氮儀，瑞典Foss集團(tuán)；CR22 GII高速冷凍離心機(jī)，日本Hitachi公司；TA.XT2i Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；CR-400型便攜式色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 雞骨蛋白提取 雞骨架經(jīng)破碎、清洗，去除血水和雜質(zhì)后放入提取罐，按骨渣質(zhì)量比1﹕1.5加水。升溫至（130±0.5）℃，0.175 MPa時恒溫，分別在恒溫0、20、40、60、90和120 min時取樣，并過200目篩以除去雞骨殘渣，采用離心法（16 000×）去油，所得雞骨蛋白樣品置于-80℃冰箱保存，用于后續(xù)分析、檢測。

1.3.2 總固形物和粗蛋白含量測定 總固形物（total soluble substance，TSS）含量采用MASTER-53M 手持式折射儀直接測定。粗蛋白含量采用半微量凱氏定氮法測定[10]。每組樣品平行測定3次。

1.3.3 羥脯氨酸含量測定 羥脯氨酸（Hyroxyproline，Hyp）含量測定參考Bertram等[12]的方法并略作修改。取100 mg樣品加入5 mL 6 mol·L-1HCl于110℃下水解24 h。水解液用活性炭吸附后，單層濾紙過濾，用10 mol·L-1和1mol·L-1NaOH調(diào)濾液pH至6.0，然后用蒸餾水定容至50 mL。取出4 mL定容后溶液加入2 mL氯氨T，混勻，室溫放置20 min。然后加入2 mL顯色劑，搖勻，60℃水浴20 min。樣品用流水冷卻5 min，在558 nm下測吸光度。每組樣品平行測定3次。

1.3.4 分子量分布測定 參考IRVINE等[13]的方法，采用體積排阻色譜法（SEC）測定雞骨蛋白的分子量分布，每組樣品平行測定3次。色譜條件為：色譜柱，TSK G2000SWXL（30 cm×7.8 mm，5 μm）；洗脫液，乙腈/超純水/三氟乙酸（45/55/0.1，v/v/v）；流速，0.6 mL·min-1；柱溫，30℃；檢測波長，220 nm；上樣量，10 μL。以細(xì)胞色素C（12.5 kDa）、抑肽酶（6.5 kDa）、桿菌肽（1.45 kDa）、乙氨酰氨-乙氨酰氨-精氨酸（451 Da）和乙氨酰氨-乙氨酰氨-乙氨酸（189 Da）標(biāo)準(zhǔn)品與保留時間擬合直線方程為：=-0.26+6.78，2=1.00，其中為保留時間（單位：min），為標(biāo)準(zhǔn)品分子量的對數(shù)。

1.3.5 傅里葉紅外分析 采用傅里葉變換紅外光譜儀（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析不同抽提時間蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化。參照李俠等[14]的方法并略作修改，采用多次衰減全反射技術(shù)（attenuated total reflection，ATR）進(jìn)行測量。取相同體積樣品置于ATR附件上掃描，采用OMNIC軟件記錄譜圖，并利用儀器的差減軟件進(jìn)行差減去除水的干擾。測定范圍4 000—400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)100次。利用PeakFit 4.12（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）軟件對紅外光譜酰胺Ⅰ帶（1 700—1 600 cm-1）譜峰進(jìn)行處理。

1.3.6 凝膠強(qiáng)度測定 凝膠強(qiáng)度測定參考PANG等[15]的方法并略作修改。將雞骨蛋白溶液凍干后復(fù)溶至同一濃度（6.67%，以粗蛋白計），4℃孵育（17±1）h后進(jìn)行凝膠強(qiáng)度測定，每組樣品平行測定3次。儀器采用TA.XT2i Plus質(zhì)構(gòu)儀，探頭型號P/0.5，測前速度2.0 mm·s-1，測試速度1.0 mm·s-1，測后速度2.0 mm·s-1，壓縮比例30%，負(fù)荷5 g，測定溫度25℃。

1.3.7 凝膠持水性測定 凝膠持水性（water holding capacity，WHC）測定參考ZHOU等[16]的方法并略作修改。量取等體積樣品于離心管中，4℃孵育（17±1）h制備凝膠，6 000×離心15 min（4℃）后去除離出水分，記錄空離心管質(zhì)量及離心前后離心管與凝膠的總質(zhì)量，每組樣品平行測定3次。凝膠持水性按式（1）計算：

WHC（%）=（W2?W）/（W1?W）×100% （1）

式中，W為離心管重量，W1為離心前離心管和蛋白凝膠總重量，W2為離心后離心管和蛋白凝膠總重量。

1.3.8 雞骨蛋白溶液透明度測定 CBP溶液透明度測定參考劉小玲[17]的方法并略作修改。測定同濃度的雞骨蛋白溶液在660 nm處的吸光值A(chǔ)，每組樣品平行測定3次。根據(jù)公式（2）換算為透過率transmittance（T），T越大，溶液的透明度越高。

公式如下：

A= ?lgT （2）

1.3.9 凝膠色澤測定 凝膠色澤測定參考王春青等[18]的方法并略作修改。使用便攜式色差儀直接測定凝膠表面的亮度值L*、紅度值a*和黃度值b*，+a*表示樣品偏紅，?a*表示偏綠，+b*表示樣品偏黃，?b*表示樣品偏藍(lán)。每組樣品平行測定3次。色差計使用前用白板校準(zhǔn)。白度值W計算公式如下：

W=100?[（100?L*）2+a*2+b*2]1/2（3）

1.4 統(tǒng)計分析

采用SAS 9.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，用ANOVA 進(jìn)行方差分析，Duncan進(jìn)行顯著性檢驗（＜0.05）。使用Microsoft Excel 2013軟件繪圖，同一圖或表中不同的小寫字母表示差異顯著（＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 抽提時間對TSS、粗蛋白含量和粗蛋白提取率的影響

TSS、粗蛋白含量和提取率變化規(guī)律如表1所示。隨著抽提時間的延長，TSS和粗蛋白含量均顯著增加，TSS從開始時的0.97%增加到120 min的5.43%；粗蛋白含量從開始時的0.92%增加到120 min的5.01%（＜0.05）。0—90 min粗蛋白含量增幅較大，90—120 min增幅趨于平緩，與粗蛋白提取率結(jié)果一致。說明熱壓抽提破壞了雞骨堅硬的結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)和少量的可溶性有機(jī)化合物不斷溶出，并且大部分蛋白在前90 min已經(jīng)被提取溶出[9]。

表1 熱壓抽提時間對TSS、粗蛋白含量和粗蛋白提取率的影響

同一列不同字母表示差異顯著（＜0.05）。下同

Different letters in the same column are significantly differences (＜0.05). The same as below

對相同時間點(diǎn)的TSS和粗蛋白含量進(jìn)行回歸分析得到線性方程=0.78+0.61（其中：為TSS，為粗蛋白含量），方程回歸性顯著（＜0.05），決定系數(shù)2=0.93，說明該方程擬合性良好。利用此方程可以對熱壓抽提過程中粗蛋白含量進(jìn)行預(yù)測，實(shí)現(xiàn)了雞骨蛋白生產(chǎn)過程中粗蛋白含量的在線預(yù)測，大大節(jié)省檢測時間和成本。

2.2 抽提時間對羥脯氨酸（Hyp）含量的影響

雞骨富含膠原蛋白，熱壓抽提過程中，膠原蛋白變成可溶性水解物溶出，其變化規(guī)律與Hyp一致[19]。Hyp含量的變化會影響凝膠強(qiáng)度等凝膠性質(zhì)[20]。雞骨蛋白中Hyp變化規(guī)律如圖1所示。隨著抽提時間延長，Hyp含量從0 min的0.08 mg·g-1顯著增加到90 min的3.77 mg·g-1（＜0.05），90和120 min的Hyp含量無顯著性差異（＞0.05）。結(jié)果表明抽提時間會顯著影響Hyp含量（＞0.05），抽提時間越長，雞骨中的膠原蛋白溶出越多，但是隨著提取的進(jìn)行，膠原蛋白溶出速度減緩，表明大部分膠原蛋白已經(jīng)被提取溶出。

柱形圖上方的不同字母表示不同時間差異顯著（P＜0.05）。下同

2.3 抽提時間對分子量分布（MW）的影響

分子量的變化會顯著影響凝膠強(qiáng)度、透明度等凝膠性質(zhì)[20]。表2為不同抽提時間的CBP分子量分布，可以反映蛋白的降解情況。由表2可知，隨著提取時間延長（40—120 min），蛋白降解顯著，分子量＞30 kDa的肽段40 min 時占總蛋白的4.72%，而90 min時被全部降解；分子量在10—30 kDa的組分從40 min的59.82%降低到120 min的13.99%；而分子量＜10 kDa的肽段從40 min的35.46%升高到120 min的86.01%。原因在于，隨著抽提時間延長，高分子量的蛋白不斷溶出，并降解為低分子量多肽和氨基酸。這與YANG等[21]的研究結(jié)果一致，YANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)高溫會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解為小分子蛋白。KIJOWSKI等[2]也指出，雞骨富含膠原蛋白，加熱到膠原蛋白變性溫度以上會導(dǎo)致氫鍵斷裂、三股螺旋結(jié)構(gòu)展開，蛋白降解為不同分子量的多肽段。

表2 凝膠分子量分布變化

2.4 抽提時間對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

圖2為不同時間提取的CBP的紅外光譜圖。由圖2可知，不同抽提時間的譜圖趨勢相似，但是隨著抽提時間延長而有所改變。紅外光譜的改變表明蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生轉(zhuǎn)變，包括酰胺A帶（2 300—3 600 cm-1）[22]，酰胺Ⅰ帶（1 636—1 661 cm-1），酰胺Ⅱ帶（1 549— 1 558 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 200—1 300 cm-1）的變化[23]。MUYONGA 等[24]將1 600—1 700 cm-1歸屬為酰胺Ⅰ帶。HASHIM等[22]將1 550—1 520 cm-1歸屬為酰胺Ⅱ帶，并指出此頻率變化與N-H鍵變形有關(guān)。而SUREWICZ等[25]認(rèn)為酰胺Ⅱ帶與存在于脂肪、蛋白質(zhì)、多糖及磷酸衍生物中的基團(tuán)振動有關(guān)。

圖2 熱壓抽提時間對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

基于以上歸屬，CBP的FTIR光譜確認(rèn)1 600— 1 700 cm-1為酰胺Ⅰ帶，1 330—1 600 cm-1為酰胺Ⅱ帶，1 200—1 300 cm-1為酰胺Ⅲ帶（圖2）。由圖可知，與酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶相比，酰胺Ⅲ帶強(qiáng)度較弱，這與熱壓提取雞骨蛋白導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)[24]。酰胺Ⅱ帶變化可能是因為熱處理導(dǎo)致N-H鍵變形，并且可能與構(gòu)成骨架的脂肪、蛋白質(zhì)、多糖和磷酸衍生物中的基團(tuán)振動相關(guān)。

酰胺Ⅰ帶（1 600—1 700 cm-1）主要是由C=O的伸縮振動引起，對研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)最有價值[14]。通常情況下，將1 615—1 637 cm-1和1 682—1 700 cm-1歸屬為β-折疊和反平行β-折疊，1 646—1 664 cm-1歸屬為α-螺旋，1 637—1 645 cm-1歸屬為無規(guī)則卷曲，1 664—1 681 cm-1歸屬為β-轉(zhuǎn)角[14]?；谝陨蠚w屬，熱壓抽提得到的CBP的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋 （1 646、1 650和1 651 cm-1）和β-折疊（1 620、1 623 cm-1）組成，β-轉(zhuǎn)角和反平行β-折疊并未觀測到（表3）。0—40 min的CBP酰胺Ⅰ帶由100%的α-螺旋組成，60—90 min時出現(xiàn)9.9%—17.6%的β-折疊結(jié)構(gòu)，120 min時β-折疊全部降解。該結(jié)果與相關(guān)報道一致，MUYONGA等[24]研究表明維持雞骨蛋白二級結(jié)構(gòu)的主要作用力為氫鍵，熱處理導(dǎo)致氫鍵破壞和蛋白降解，其中膠原蛋白三股螺旋主要分解為完整的α鏈。此外，ZHANG等[26]研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的熱變性會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不可逆沉淀及β-折疊結(jié)構(gòu)展開為無序結(jié)構(gòu)。CBP二級結(jié)構(gòu)的以上變化會影響凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成而影響凝膠特性[27]。

表3 峰位置和相對百分面積分布

ND表示未檢出 ND means not detected

2.5 抽提時間對凝膠強(qiáng)度、持水性（WHC）和CBP溶液透明度的影響

通常認(rèn)為凝膠強(qiáng)度越大，凝膠質(zhì)量越好[28]。不同抽提時間的CBP凝膠強(qiáng)度的變化規(guī)律如圖3-a所示。抽提開始時的雞骨蛋白并未形成凝膠，20、40和60 min組的凝膠強(qiáng)度無顯著性差異（＞0.05），均顯著高于90和120 min組。原因可能在于，20—60 min的CBP中高分子量組分比例高于90和120 min組，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更好[4]，故凝膠強(qiáng)度較大，這與EYSTURSKARD等[29]的研究結(jié)果相似。此外，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化也會影響凝膠強(qiáng)度[30-31]。

WHC指離心過程中凝膠對水的保持能力，WHC越高，表明凝膠對水的保持能力越強(qiáng)，凝膠質(zhì)量越好。由圖3-b可知，不同時間提取的CBP凝膠持水性均大于90%，且無顯著性差異（＞0.05），表明不同抽提時間的CBP凝膠都對水有較好的保持能力。這與DE MORAES等[4]的研究結(jié)果相似，DE MORAES等[4]研究表明酸性條件下加熱溫度和時間對凝膠的持水性均沒有影響。

制備凝膠的溶液透明度越高，凝膠可接受度越高。不同抽提時間的CBP的透明度變化規(guī)律如圖3-c所示。隨著抽提時間延長（20—120 min），溶液透明度顯著升高（＜0.05）。原因可能在于，20 min的CBP中高分子量物質(zhì)比例較高，溶解性差，降低了CBP透明度，但隨著抽提時間延長，大分子物質(zhì)不斷被降解，溶解性變好，故CBP的透明度升高，這和劉小玲[17]的研究結(jié)果一致。

圖3 熱壓抽提時間對凝膠強(qiáng)度、持水性和CBP溶液透明度的影響

2.6 抽提時間對凝膠色澤的影響

由表4可知，抽提時間會顯著影響CBP凝膠的色澤（＜0.05）。不同抽提時間的CBP凝膠的L*和W值差異顯著（＜0.05）；40、60和90 min組的a*值無顯著性差異（＞0.05），均低于20和120 min組；20 min組的b*值最大，其他各組差異不顯著（＞0.05）。造成凝膠色澤差異的原因主要有兩點(diǎn)，一是雞骨在抽提過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生褐色素使CBP顏色加深，且加熱時間越長，褐變越嚴(yán)重，CBP顏色越深[10,31]；二是將樣品調(diào)至同一濃度時，濃縮倍數(shù)不同，因而顏色不同，二者共同導(dǎo)致凝膠色澤差異顯著（＜0.05）。根據(jù)優(yōu)質(zhì)凝膠的標(biāo)準(zhǔn)，即高亮度、低黃度、高白度[30]，綜合考慮CBP凝膠的L*、b*和W，40和60 min組的凝膠色澤最佳。

表4 凝膠色澤比較

2.7 相關(guān)性分析

表5為不同抽提時間CBP的Hyp含量、CBP降解程度與凝膠特性的相關(guān)性關(guān)系。由表5可知，凝膠強(qiáng)度與10—30 kDa的CBP比例極顯著正相關(guān)，而與＜10 kDa的CBP比例極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.78和-0.82，原因在于10—30 kDa蛋白比例越高，＜10 kDa蛋白比例越低，形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越好，凝膠強(qiáng)度越大。透過率與10—30 kDa的CBP的比例顯著負(fù)相關(guān)，而與＜10 kDa的CBP的比例極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為-0.70和0.75，原因在于＜10 kDa的CBP溶解性優(yōu)于10—30 kDa的CBP，所以＜10 kDa的CBP比例越高，蛋白溶解性越好，溶液透過率較高。WHC與Hyp的含量極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.94，原因在于Hyp含量反映了雞骨蛋白中膠原蛋白的含量，其含量越高，形成氫鍵數(shù)量越多，從而形成致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)束縛水分子的運(yùn)動。L*與透過率極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.70，因為雞骨在抽提過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生褐色素使CBP顏色加深，且加熱時間越長，CBP顏色越深，同時蛋白發(fā)生降解，蛋白溶解性越好，溶液透過率較高。

表5 不同抽提時間凝膠各指標(biāo)間相關(guān)性分析

**代表在0.01水平有顯著性差異，*代表在0.05水平有顯著性差異

** means correlation is significant at the 0.01 level, * means correlation is significant at the 0.05 level

3 討論

3.1 抽提時間對TSS、粗蛋白和羥脯氨酸含量的影響

雞骨中蛋白含量約為19%，其中35%—40%為膠原蛋白。膠原蛋白由三條亞基鏈構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)，在常溫下結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，溶解性較差。高溫高壓抽提能夠使蛋白結(jié)構(gòu)破壞，膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)解旋為單鏈而溶于水。WANG等[8]研究表明加熱溫度越高、時間越長，雞骨中可溶性物質(zhì)越多，粗蛋白和羥脯氨酸含量越高。本研究中，隨著加熱時間延長，TSS、粗蛋白和羥脯氨酸含量均顯著增加（＜0.05），與WANG等[8]的研究結(jié)果一致。

3.2 抽提時間對分子量分布（MW）的影響

雞骨在抽提過程中，高分子量的蛋白降解為低分子量的蛋白，再降解為多肽、小分子肽和游離氨基酸。有研究表明高溫更能促使蛋白質(zhì)的降解，且加熱時間越長，蛋白降解程度越高[8]。YANG等[21]指出長時間加熱會導(dǎo)致蛋白質(zhì)過度降解，高分子量組分比例降低，低分子量組分比例升高。本研究（表2）也發(fā)現(xiàn)，隨著提取時間延長（40—120 min），蛋白發(fā)生顯著降解，分子量在10—30 kDa的組分比例降低了45.83%；而分子量＜10 kDa的肽段比例升高了50.55%，與上述研究結(jié)果相似。

3.3 抽提時間對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的影響

目前，F(xiàn)TIR廣泛用于蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)研究，其酰胺I帶（1 600—1 700 cm-1）對羰基的幾何振動和氫鍵結(jié)構(gòu)非常敏感。隨著加熱溫度和時間的改變，蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)變化，反映為譜圖形狀和強(qiáng)度的變化。盧雁等[32]研究表明隨著加熱溫度的升高，蛋白質(zhì)α-螺旋含量逐漸減少，β-折疊含量增加。α-螺旋是蛋白質(zhì)分子內(nèi)的有序排列，通過分子內(nèi)氫鍵維持。在加熱條件下其含量降低表明加熱導(dǎo)致維持 α-螺旋的氫鍵作用減弱，蛋白質(zhì)分子展開程度增加；β-折疊是蛋白質(zhì)分子間的有序排列，通過分子間氫鍵維持，加熱后其含量增加表明蛋白質(zhì)分子間氫鍵作用增強(qiáng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間聚集程度增加[33]。鐘朝輝等[34]研究了加熱對魚鱗膠原蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明高溫使維系膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵破壞，逐漸解螺旋并轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則、轉(zhuǎn)角和折疊結(jié)構(gòu)。本研究中，隨著加熱時間延長（60—90 min），α-螺旋含量降低，β-折疊含量升高，可能是加熱導(dǎo)致α-螺旋解旋并重排為β-折疊；而120 min的β-折疊含量為零，可能是α-螺旋解旋速率越來越快，導(dǎo)致展開后的蛋白質(zhì)來不及重排成β-折疊結(jié)構(gòu)，同時已經(jīng)存在的β-折疊被降解。

3.4 抽提時間對凝膠特性和溶液透明度的影響

凝膠強(qiáng)度是衡量凝膠質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，商業(yè)凝膠的凝膠強(qiáng)度為100—300 g[35]，主要與凝膠來源和凝膠提取方法等因素有關(guān)[19,26]。不同物種來源的膠原蛋白分子的結(jié)構(gòu)組成不同、復(fù)雜程度不一，其三股螺旋分子間交聯(lián)度的差異造成熱穩(wěn)定性不同，直接影響凝膠強(qiáng)度等功能特性[36]。通常，來源于豬、牛的凝膠強(qiáng)度為200—240 g，而魚的凝膠強(qiáng)度差異較大，為0—270 g。此外，凝膠提取的熱處理程度也會影響其凝膠強(qiáng)度。CHEN等[5]研究表明過度加熱會導(dǎo)致低分子量組分比例升高，凝膠強(qiáng)度減小。DE MORAES等[4]也發(fā)現(xiàn)加熱時間會影響蛋白質(zhì)水解程度進(jìn)而影響蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度。本研究中（圖3-a），20、40和60 min組的凝膠強(qiáng)度均高于100 g，優(yōu)于90和120 min組，與CHEN等[5]研究結(jié)果一致。但是，CBP凝膠強(qiáng)度低于豬、牛的凝膠強(qiáng)度，可能是因為CBP是混合蛋白，而文獻(xiàn)研究的是高純度膠原蛋白的凝膠強(qiáng)度；此外，原料種類對其凝膠強(qiáng)度也有影響。

董憲兵[10]研究發(fā)現(xiàn)，隨著抽提時間延長，CBP中高分子量組分溶解性變好，溶液透明度升高，但是會發(fā)生輕微的美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生褐色素使CBP顏色變深。DE MORAES等[4]也指出，高溫導(dǎo)致蛋白質(zhì)等富含羰基和氨基的物質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而影響蛋白凝膠的色澤。本研究中不同時間的CBP凝膠色澤差異顯著，即與高溫下蛋白質(zhì)的美拉德反應(yīng)有關(guān)。

4 結(jié)論

抽提時間對總固形物、粗蛋白含量、羥脯胺酸含量和雞骨蛋白的降解程度均有顯著影響。隨著抽提時間延長，總固形物、粗蛋白和羥脯胺酸含量均顯著增加，粗蛋白提取率顯著升高。高分子量的蛋白隨著抽提時間延長不斷溶出，并降解為低分子量多肽和氨基酸，提取液透明度顯著升高。抽提時間對雞骨蛋白凝膠特性有顯著影響，20、40和60 min組的凝膠強(qiáng)度優(yōu)于90和120 min組，色澤分析表明40和60 min組的雞骨蛋白制備的凝膠色澤最佳。綜上所述，提取時間為40和60 min的粗蛋白綜合品質(zhì)優(yōu)于其他各組，因此更適合制備凝膠。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

Effect of Extraction Time on Characteristics of Gelatin and Secondary Structure of Chicken Bone Protein

YUE JianYing1, WANG JinZhi1, ZhANG ChunHui1, DU GuiHong2, XU Xiong2

(1Institute of Agro-Products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences/Comprehensive Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Beijing 100193;2Hebi Protil Biotechnology Co., Ltd, Hebi 456750, Henan)

【Objective】Hot-pressure extraction was utilized to prepare chicken bone protein (CBP) to study the effect of extraction time on gelatin properties. The study was expected to provide a reference for the preparation technology of edible gelatin by using chicken bone by-products. 【Method】After being adjusted to the same concentration of protein, CBP at different extraction times were incubated at 4℃ to form gelatin. The content of total soluble substance (TSS), crude protein and hydroxyproline (Hyp), secondary structure of protein and distribution of molecular weight (MW), as well as color of gelatin and gel strength were studied. Furthermore, correlation analysis between indexes of CBP was also performed to establish possible linkages between physicochemical properties and gelatin properties of CBP.【Result】The results showed that hot-pressure extraction time had a significant effect on the yield of CBP (＜0.05), leading to the variable structure of protein and consequently affected the properties of gelatin made by CBP. The contents of TSS, crude protein and Hyp were increased significantly during extraction (0-120 min) (＜0.05). The result of MW distribution suggested that protein experienced dramatic degradation from 40 to 120 min (＜0.05). The proportion of MW between 10 and 30 kDa decreased from 59.82% (40 min) to 13.99% (120 min) while the ratio of MW＜10 kDa increased from 35.46% (40 min) to 86.01% (120 min). In addition, the extraction time caused the denaturation of protein and thus leading to the change of secondary structure. The CBP was composed of 100 percent of α-helix (0-40 min), and then β-sheet emerged at 60 and 90 min (9.9% and 17.6%, respectively) but disappeared at 120 min, which indicated that the secondary structure of protein experienced transformation during extraction. Results of CBP gelatin properties suggested that CBP at 0 min could not form a gelatin and thus had no gelatin properties. Gel strength at 20, 40 and 60 min was at same level and better than CBP gelatins of 90 and 120 min. In addition, transparency of CBE solutions was significantly impacted by extraction time, which increased sharply during hot-pressure extraction (20-120 min) (＜0.05). Meanwhile, extraction time significantly affected the color of gelatins (＜0.05) and gelatin at 40 and 60 min met the requirements of high lightness, low yellowness and high whiteness. However, water holding capacity was insensitive to the extraction time (＞0.05). Correlation analysis showed that the content of Hyp, degradation of protein were considerably related to gelatin properties (＜0.05).【Conclusion】In conclusion, extraction time could significantly affect the gelatin properties prepared by CBP at different extraction times. Given yield of protein, color of gelatin, gel strength, etc., CBP extracted at 40 min and 60 min were better proper for preparation of gelatin.

chicken bone protein; hot-pressure extraction; extraction time; gelatin properties; secondary structure

2016-03-18；接受日期：2016-12-21

國家自然科學(xué)基金（31401623）、對發(fā)展中國家科技援助項目（KY201401005）

岳鑒穎，E-mail：13161134960@163.com。 通信作者張春暉，Tel：010-62815950；E-mail：dr_zch@163.com