閆曉平，趙丹，郭巍,2，王偉，張雅昆，郜玉杰，趙坤莉

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美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶的克隆、表達及酶學(xué)性質(zhì)

閆曉平1，趙丹1，郭巍1,2，王偉1，張雅昆1，郜玉杰1，趙坤莉1

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，河北保定071000；2北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206）

【目的】研究美國白蛾（）幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）基因的酶學(xué)性質(zhì)，了解其在昆蟲生命過程中如何發(fā)揮功能，為美國白蛾的生物防治提供新靶標(biāo)?！痉椒ā?對家蠶（）、棉鈴蟲（）和云杉卷夜蛾（）3種鱗翅目昆蟲的幾丁質(zhì)脫乙酰酶2序列保守域進行分析，采用同源比對方法，設(shè)計幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因特異引物，利用PCR擴增該基因全長cDNA序列；構(gòu)建原核重組表達載體pET30a-，克隆獲得編碼美國白蛾HcCDA2的基因，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，SDS-PAGE電泳檢測；構(gòu)建重組桿狀病毒表達載體pFastBac-和pFastBac-，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Hi5，分別獲得P1、P2、P3病毒，收集P3病毒上清，得到美國白蛾HcCDA1（前期研究所得）和HcCDA2重組蛋白，Western blot分析；重組蛋白HcCDA1和HcCDA2經(jīng)硫酸銨粗純化后，以對硝基乙酰苯胺為底物，測定重組幾丁質(zhì)脫乙酰酶HcCDA1&2的酶活力，對其最適反應(yīng)溫度、最適pH以及金屬離子的影響等酶學(xué)性質(zhì)進行研究?！窘Y(jié)果】 獲得了編碼美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因全長cDNA序列，命名為(GenBank登錄號：KT781841)，基因全長1.6 kb，該基因在大腸桿菌中成功表達61 kD目的蛋白，免疫家兔獲得HcCDA2蛋白的特異性多克隆抗體。Western blot分析結(jié)果表明，和在昆蟲細(xì)胞（Hi5）中均成功表達約80 kD蛋白。酶學(xué)性質(zhì)研究表明，昆蟲細(xì)胞中分泌表達的HcCDA1和HcCDA2均具有催化活性，兩種酶的最適反應(yīng)溫度均為50℃，當(dāng)溫度達到80℃時，HcCDA2幾乎失去酶活力；HcCDA1酶促反應(yīng)適宜的pH范圍為7.0—9.0，并且HcCDA1和HcCDA2酶促反應(yīng)的最適pH均為8.0；在最適反應(yīng)條件下，HcCDA2蛋白酶活力均高于HcCDA1蛋白酶活力；Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+對HcCDA1和HcCDA2酶促反應(yīng)整體呈抑制趨勢，隨濃度增大，Zn2+對HcCDA1抑制作用逐漸增強，而Mg2+對HcCDA1的抑制作用則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而且Mg2+和Ca2+對HcCDA2的抑制作用也是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。Co2+和Fe2+對HcCDA1和HcCDA2酶促反應(yīng)有激活作用，隨濃度增大，F(xiàn)e2+激活作用越強，而Co2+激活作用則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢?！窘Y(jié)論】克隆了編碼美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因（），在原核細(xì)胞中表達61 kD目的蛋白，免疫家兔獲得HcCDA2蛋白的特異性抗體。得到具有活性的美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶HcCDA1和HcCDA2，兩者在體外均檢測到催化活性，兩種酶的最適反應(yīng)溫度均為50℃，最適pH均為8.0。

美國白蛾；幾丁質(zhì)脫乙酰酶；克隆表達；酶學(xué)性質(zhì)

0 引言

【研究意義】美國白蛾（）是一種重要的林木上的危險性害蟲。幾丁質(zhì)作為結(jié)構(gòu)內(nèi)容物是昆蟲表皮、中腸上皮細(xì)胞和圍食膜的重要組成成分[1]，對昆蟲外骨骼和體內(nèi)組織的形態(tài)和大小維持及蛻皮發(fā)育起著重要作用[2-3]。昆蟲發(fā)育必須經(jīng)歷周期性去舊表皮和合成新表皮的過程，這一過程伴隨著幾丁質(zhì)的合成和降解。多種酶參與幾丁質(zhì)的降解過程，幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，簡稱CDA，EC.3.5.1.41）是幾丁質(zhì)降解酶系成員之一，能夠催化幾丁質(zhì)中-1, 4-糖苷鍵連接的-乙酰基葡糖胺中乙酰氨基的水解[4]。酶是具有催化功能的蛋白質(zhì)，研究其酶學(xué)性質(zhì)有助于了解酶的催化機理，而研究酶學(xué)性質(zhì)的前提是獲得大量的高純度的酶。【前人研究進展】早在1974年，Araki等[5]從接合菌綱的雙相型真菌中發(fā)現(xiàn)了CDA，并對該酶的相關(guān)性質(zhì)進行了研究；1975年，Araki等[6]又研究了金屬離子對中CDA酶活力的影響；1982年，Kauss等[7]從植物病原體中提取到CDA，研究發(fā)現(xiàn)其酶活力不受乙酸的抑制，這是從非結(jié)合菌中發(fā)現(xiàn)該酶的最早報道；2005年，蔡俊等[8]采用固體平板培養(yǎng)和液體發(fā)酵從實驗室保存的真菌中篩選出和兩株產(chǎn)CDA酶活性較高的菌株，并研究了目標(biāo)菌株的碳源、氮源、離子影響及酶學(xué)性質(zhì)；2006年，蔣霞云等[9]對毛霉、根霉、曲霉和青霉4株霉菌在對數(shù)生長末期和穩(wěn)定期末期的胞內(nèi)和胞外CDA活力進行了研究；2008年，Toprak等在McCDAl原核表達的包涵體中測到蓓帶夜蛾（）CDA1的酶活，幾丁質(zhì)脫乙酰酶參與改變圍食膜中幾丁質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，這一生化過程不僅改變幾丁質(zhì)的纖維結(jié)構(gòu)，而且對圍食膜蛋白的結(jié)合程度、圍食膜的完整性和孔隙率產(chǎn)生影響[10-11]。2012年，ZHONG等[12]利用畢赤酵母真核表達系統(tǒng)表達獲得家蠶（）BmCDA7的可溶蛋白，經(jīng)過硫酸銨粗純化后，利用對硝基乙酰苯胺法測定其酶活力為1.85 U·mL-1；2015年，孫曉彤等[13]測得畢赤酵母中表達的重組SeCDA1蛋白酶活力為1.35 U·mL-1；2016年，危蓉萍等[14]克隆了蜜蜂螺原體幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因，并得到具有活性的外源目的蛋白，測得外源表達的該酶活力最高可達10.14 U·mL-1，最適溫度為50℃左右，最適pH為7.0—7.5，為后續(xù)研究螺原體與宿主蜜蜂的相互作用及其致病機制提供了重要信息?！颈狙芯壳腥朦c】目前，多數(shù)文獻集中于對基因分子特性的研究，而幾丁質(zhì)脫乙酰酶作為具有催化功能的蛋白質(zhì)，不僅要明確其生理功能，還要深入研究其酶學(xué)性質(zhì)。酶學(xué)性質(zhì)的研究有助于對酶催化機理的了解，進而明確該酶對昆蟲發(fā)育的影響?！緮M解決的關(guān)鍵性問題】對美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因（）的cDNA序列進行克隆，獲取該基因全長并進行克隆表達，同時對前期獲得的進行昆蟲細(xì)胞表達，采用對硝基乙酰苯胺法對HcCDAs蛋白活性進行檢測，為明確該基因的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院完成。

1.1 供試?yán)ハx和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)

美國白蛾卵于2015年購自中國林業(yè)科學(xué)研究院，將其置于（26.0±1.0）℃，RH 75%±10%，光周期16L﹕8D的培養(yǎng)箱中孵化，待其孵化為1齡幼蟲后飼喂人工飼料，直至其蛻皮為5齡幼蟲時開展試驗。HighFive（Hi5）細(xì)胞系由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)李國勛教授惠贈，于（26.5±0.5）℃，25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，TNMFH昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基由Grace培養(yǎng)基改進，并輔以10%胎牛血清（四季青公司）。

1.2 主要菌株及試劑

大腸桿菌JM109、BL21，載體pET30a，為筆者實驗室保存；cDNA序列及蛋白特異抗體為筆者實驗室前期所得。pFastBacTM、DH10Bac和Cellfectin Ⅱ Reagent來自Bac- to-Bac Expression System Kit（購自Invitrogen公司）。RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司，限制性內(nèi)切酶均購自Promega公司，快速連接酶、預(yù)染Protein Marker購自Thermo公司。

1.3 總RNA的提取及第一鏈cDNA的合成

解剖昆蟲5齡幼蟲表皮，于DEPC處理過的滅菌水中反復(fù)漂洗，在干凈的平皿上盡量除去多余的DEPC水后，將其裝入1.5 ml無菌離心管中，立即投入液氮冷凍后，-80℃保存。提取總RNA，具體步驟參見QIAGEN試劑盒使用說明，按照Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，取1.2 μg RNA用于反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，反應(yīng)體系為42℃ 60 min，95℃ 5 min，4℃ 5 min，立即取出。

1.4基因全長cDNA序列的獲得

利用DNAMAN軟件對家蠶（GenBank：HM450150.1）、棉鈴蟲（）（GenBank：KM598637.1）、云杉卷夜蛾（）（GenBank：KC285591.1）3種昆蟲幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因的cDNA序列進行比對，設(shè)計適用于克隆的特異引物（表1，F(xiàn)1/R1），以合成的cDNA為模板擴增幾丁質(zhì)脫乙酰酶序列的特異片段，送至上海生工生物工程公司測序。根據(jù)已知序列設(shè)計RACE-PCR引物以期獲得全長序列（未成功），同時對已知序列進行NCBI-BLAST分析，根據(jù)同源序列設(shè)計簡并引物（表1，F(xiàn)2/R2），PCR擴增獲得基因全長cDNA序列。

1.5在大腸桿菌中的表達

根據(jù)原核表達載體pET30a設(shè)計包含酶切位點的特異引物（表1，F(xiàn)3/R3，I &I），以cDNA為模板，通過PCR擴增獲得全長基因（），將載體和目的基因分別雙酶切后進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選以及鑒定，并將鑒定正確的重組子（pET30a-）在37℃條件下以0.8 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，超聲破碎后12 000 r/min離心5 min，將沉淀溶于10 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0），加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，取20 μL樣品進行檢測，以未誘導(dǎo)的（pET30a-）作為陰性對照，SDS-PAGE電泳，考染檢測。

1.6和在昆蟲細(xì)胞中表達

根據(jù)真核表達載體pFastBac設(shè)計包含酶切位點的特異引物（表1，F(xiàn)4/R4，I &I；F5/R5，H I＆R I），以cDNA為模板，通過PCR擴增分別獲得和全長基因序列，分別酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選并鑒定陽性重組子后將得到的陽性重組子送至上海生工生物工程公司測序。然后將重組桿狀病毒表達載體 pFastBac-和pFastBac-分別轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定重組Bacmid-和Bacmid-，選取鑒定正確的重組Bacmid，利用Cellfectin Ⅱ reagent轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Hi5，獲得重組病毒P1，繼續(xù)侵染Hi5細(xì)胞分別得到P2和P3病毒，收集P3病毒上清得到重組蛋白。以轉(zhuǎn)染空載體的Hi5細(xì)胞培養(yǎng)液上清為對照，加入等體積的2×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，取20 μL樣品進行SDS-PAGE電泳，分別以HcCDA1和HcCDA2蛋白特異抗體為一抗，Western blot分析重組蛋白HcCDA1和HcCDA2的表達。

表1 美國白蛾P(guān)CR擴增和表達引物

方框標(biāo)示的為酶切位點The boxes marked the restriction sites

1.7 美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶HcCDA酶學(xué)性質(zhì)分析

對硝基乙酰苯胺本身為無色固體，苯環(huán)上的乙酰氨基能夠被水解生成具有游離氨基的對硝基苯胺，在400 nm條件下有特異性吸光值。重組蛋白HcCDA1和HcCDA2經(jīng)硫酸銨粗純化后以對硝基乙酰苯胺作為反應(yīng)底物，根據(jù)鐘曉武[15]的方法進行脫乙酰基酶活力測定。

1.7.1 重組HcCDA最適反應(yīng)溫度 在pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，反應(yīng)溫度分別為30、40、50、60、70、80℃，反應(yīng)時間為15 min，測定不同溫度條件下的酶活力。酶活力最高為100%，其余為相對酶活，分別確定HcCDA1和HcCDA2蛋白的最適反應(yīng)溫度。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

1.7.2 重組HcCDA最適反應(yīng)pH 測定不同pH反應(yīng)液（pH 3.0—9.0 Tris-HCl）條件下的酶活力，50℃水浴反應(yīng)15 min。酶活力最高為100%，其余為相對酶活，分別確定HcCDA1和HcCDA2蛋白的最適反應(yīng)pH。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

1.7.3 金屬離子對酶活力影響 不同金屬離子對酶活力的影響有較大差別，采用上述試驗中確定的最適溫度和最適pH，在酶液中添加Ca2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Mn2+，調(diào)整離子濃度分別為0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol·L-1，分別測定其酶活力。以不加金屬離子的酶活力為參照，其余為相對酶活，確定金屬離子對HcCDA1和HcCDA2蛋白的酶活力的影響。每組設(shè)置3個重復(fù)試驗。

2 結(jié)果

2.1全長基因的擴增

利用設(shè)計的引物以cDNA為模板擴增得到基因片段，擴增產(chǎn)物大小為960 bp（圖1-A），根據(jù)測序結(jié)果經(jīng)同源序列比對設(shè)計簡并引物，PCR擴增獲得全長cDNA序列，大小為1.6 kb（圖1-B）。

2.2 pET30a-重組表達載體的驗證及原核表達

將載體和目的片段分別雙酶切后進行連接、轉(zhuǎn)化、篩選以及鑒定，在37℃，IPTG濃度為0.8 mmol·L-1進行誘導(dǎo)，離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎后，在沉淀中檢測到重組蛋白表達，成功表達61 kD的目的蛋白（圖2），將重組蛋白HcCDA2經(jīng)考馬斯亮藍染色后切膠送至河北省科學(xué)院生物研究所制備多克隆抗體。

M：DNA Marker λ-EcoT14；A：1：美國白蛾CDA2基因片段

A：M：DNA Marker λ-EcoT14；1：pET30a-HcCDA2/Kpn I；2：pET30a-HcCDA2/KpnI & SacI；B：M：預(yù)染Marker Pre dye Marker；1：pET30a-HcCDA2未誘導(dǎo)Not induced；2：IPTG誘導(dǎo)8 h后pET30a-HcCDA2的表達expression of pET30a-HcCDA2after IPTG induced 8 h

2.3和重組轉(zhuǎn)座載體和重組桿狀病毒的驗證及其在昆蟲細(xì)胞中表達

首先將載體和目的片段分別雙酶切后進行連接、轉(zhuǎn)化克隆菌進行重組桿狀病毒表達載體的構(gòu)建（圖3-A、3-D），分別將重組桿狀病毒表達載體pFastBac-和pFastBac-轉(zhuǎn)化DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定出正確的重組桿狀病毒（圖3-B、3-E），然后將鑒定正確的Bacmid-和Bacmid-純化，在 CellfectionⅡ reagent作用下，分別轉(zhuǎn)染Hi5細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后72 h，在倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體的Hi5細(xì)胞相比（圖3-G），經(jīng)重組桿狀病毒侵染后的細(xì)胞由正常的梭形變?yōu)閳A形，細(xì)胞直徑增大，細(xì)胞核變大，大量細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)基中，表明細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功（圖3-H、3-I箭頭所示）。取轉(zhuǎn)染后72 h細(xì)胞上清，離心取上清進行Western blot檢測。結(jié)果表明重組病毒成功轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞Hi5，并分泌表達分子量約為80 kD的HcCDA1蛋白和HcCDA2蛋白（圖3-C、3-F）。

2.4 HcCDA1和HcCDA2酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適反應(yīng)溫度 在pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中測定不同溫度下酶活力，結(jié)果表明溫度為50℃時，酶活力最大，HcCDA1活力值為2.21 U·mL-1，HcCDA2活力為3.48 U·mL-1，溫度達到80℃時，HcCDA2幾乎失去活力（圖4）。

2.4.2 最適反應(yīng)pH 由于pH可以改變酶的構(gòu)象，引起酶分子中活性部位的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所以在過酸或過堿的條件下，酶活力會快速喪失。在50℃水浴條件下測定酶活力，結(jié)果表明HcCDA1反應(yīng)適宜的pH范圍為7.0—9.0，當(dāng)pH為8.0時，酶活力最高，為2.77 U·mL-1；當(dāng)pH為8.0時，HcCDA2酶活力最高，為4.24 U·mL-1（圖5）。

2.4.3 金屬離子的影響 在50℃水浴，pH 8.0的條件下，酶液中添加不同濃度的金屬離子，結(jié)果表明Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+對HcCDA1酶促反應(yīng)整體呈抑制趨勢；而且隨著濃度增大，Zn2+抑制作用逐漸增強，而Mg2+抑制作用呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；Ca2+在低濃度下對HcCDA1酶促反應(yīng)有激活作用，但隨著濃度增大，呈現(xiàn)出較強的抑制作用；Co2+對酶促反應(yīng)有激活作用，但是隨著濃度增大，激活作用呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；Fe2+對HcCDA1酶促反應(yīng)有激活作用，隨著濃度增大，激活作用越強；Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+對HcCDA2酶促反應(yīng)有抑制作用，隨著濃度增大，Mg2+、Ca2+抑制作用呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；Co2+對HcCDA2酶促反應(yīng)有激活作用，但隨著濃度增大，激活作用呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；Fe2+對HcCDA2酶促反應(yīng)有激活作用，隨著濃度增大，激活作用越強（表2）。

A：pFastBac-HcCDA1重組載體鑒定 Verification of the recombinant vectorpFastBac-HcCDA1。M：DNA Marker λ-EcoT14；1：pFastBac- HcCDA1/BamH I；2：pFastBac-HcCDA1/BamH I＆EcoR I；B：重組bacmid-HcCDA1 PCR鑒定 PCR verification of the recombinant bacmid-HcCDA1. M：DNA Marker λ-EcoT14；1：重組Bacmid-HcCDA1通用引物M13F/R PCR產(chǎn)物 PCR product of recombinant Bacmid-HcCDA1 with universal primers M13F/R；C：Western blot檢測HcCDA1在昆蟲細(xì)胞中表達 Western blot analysis of the HcCDA1 expression in insect cells。M：預(yù)染Marker Pre dye Marker；1：對照昆蟲細(xì)胞上清 Contrast；2：感染重組病毒Bacmid-HcCDA172 h后的昆蟲細(xì)胞上清 Supernant of insect cells infected by recombinant virus Bacmid-HcCDA1 at 72 h；D：pFastBac-HcCDA2重組載體鑒定 Verification of the recombinant vectorpFastBac-HcCDA2。M：DNA Markerλ-EcoT14；1：pFastBac-HcCDA2/Sal I；2：pFastBac-HcCDA2/Sal I & Not I；E：重組bacmid-HcCDA2 PCR鑒定 PCR verification of the recombinant bacmid-HcCDA2。M：DNA Marker λ-EcoT14；1：重組Bacmid-HcCDA2通用引物M13F/R PCR產(chǎn)物 PCR product of recombinant Bacmid-HcCDA2 with universal primers M13F/R；F：Western blot檢測HcCDA2在昆蟲細(xì)胞中表達 Western blot analysis of the HcCDA2 expression in insect cells。M：預(yù)染Marker Pre dye Marker；1：對照昆蟲細(xì)胞上清 Contrast； 2：感染重組病毒Bacmid-HcCDA2 72 h后的昆蟲細(xì)胞上清 Supernant of insect cells infected by recombinant virus Bacmid-HcCDA2 at 72 h；G：對照昆蟲細(xì)胞 Contrast；H：感染重組病毒Bacmid-HcCDA1 72 h后的昆蟲細(xì)胞 Insect cells infected by recombinant virus Bacmid-HcCDA1 at 72 h；I：感染重組病毒Bacmid-HcCDA272 h后的昆蟲細(xì)胞 Insect cells infected by recombinant virus Bacmid-HcCDA2 at 72 h

圖4 溫度對酶活力的影響

圖5 pH對酶活力的影響

表2 金屬離子對酶促反應(yīng)的影響

3 討論

幾丁質(zhì)脫乙酰酶（簡稱CDA）廣泛存在于細(xì)菌、真菌和昆蟲中，在幾丁質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著重要作用[1]，它可以將幾丁質(zhì)或者殼聚糖側(cè)鏈上的酰基基團水解下來產(chǎn)生乙酸[4]。1995年，Alfonso等[16]研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉（）的菌株自溶培養(yǎng)基中純化得到的CDA參與菌體的自溶，能將細(xì)胞壁內(nèi)切幾丁質(zhì)酶作用后產(chǎn)生的幾丁類低聚物進行脫乙酰。此外，CDA在植物與病原體的相互作用中也發(fā)揮著重要作用，病原體通過分泌CDA保護自己不受植物宿主幾丁質(zhì)酶的降解，并且保證菌絲順利穿透植物組織[17]；昆蟲CDA最早是由Guo等[18]從粉紋夜蛾（）中腸的cDNA表達文庫中得到的，該CDA屬第V類CDA蛋白，只有一個多聚糖脫乙?；复呋瘏^(qū)，該蛋白與中腸圍食膜結(jié)合緊密，雖然沒有幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，卻有很強的幾丁質(zhì)結(jié)合活性，但未測到脫乙酰基酶催化活性。2012年，ZHONG等[12]采用對硝基乙酰苯胺法測得畢赤酵母中表達的BmCDA7酶活力僅為1.85 U·mL-1；2015年，孫琳琳[19]采用熒光胺法、3-甲基-2-苯并噻唑酮腙法以及對硝基乙酰苯胺法均未檢測到畢赤酵母表達的BmCDA1催化活性；孫曉彤[20]測得畢赤酵母表達的SeCDA1酶活力僅為1.35 U·mL-1，而昆蟲細(xì)胞中表達的SeCDA1酶活力為1.88 U·mL-1，明顯高于畢赤酵母中表達的酶活力；筆者前期研究結(jié)果顯示酵母細(xì)胞中表達的HcCDA1酶活力僅為1.68 U·mL-1[21]。本研究表明昆蟲細(xì)胞中表達的重組蛋白HcCDA1和HcCDA2均具有催化活性，酶的最適反應(yīng)溫度為50℃，HcCDA1和HcCDA2活力值分別為2.21和3.48 U·mL-1；最適pH為8.0，略偏堿性，當(dāng)pH為8.0時，HcCDA1和HcCDA2酶活力為2.77和4.24 U·mL-1，明顯高于畢赤酵母中表達的酶活力，進一步體現(xiàn)了昆蟲細(xì)胞表達系統(tǒng)的優(yōu)越性。CDA蛋白分為5組（Groups），其中Group I 包括CDA1和CDA2，含有3個功能結(jié)構(gòu)域：幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ChBD）、低密度脂蛋白受體結(jié)合區(qū)（LDLa）和一個脫乙?；复呋瘏^(qū)（CDA）。Group I類CDA基因在昆蟲氣管及表皮細(xì)胞中可檢測到，其中CDA2 mRNA前體經(jīng)可變剪接和外顯子切除后產(chǎn)生2—4個亞類[22-23]。2013年，Quan等[24]發(fā)現(xiàn)云杉卷夜蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因存在2個不同的剪切子（和）；2014年，于榮榮等[25]發(fā)現(xiàn)中華稻蝗（）幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因具有2個剪切子（和）；2016年，Yu等[26]發(fā)現(xiàn)飛蝗（）幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因也存在2個不同的剪切子（和）。本研究發(fā)現(xiàn)，在昆蟲細(xì)胞中表達的HcCDA2酶活力均高于HcCDA1酶活力，推測是由于HcCDA2也存在著不同的剪切子，在催化過程中協(xié)同作用，共同發(fā)揮催化活性。

CDA是一種金屬酶，屬于糖酯酶4家族（Carbohydrate Esterase Family 4，CE4，http://www. cazy.org/fam/CE4. html）[27]。大多數(shù)CDA活性中心和其他糖酯酶4家族成員一樣含有一個金屬離子[28-29]，這一金屬離子在催化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。前人的研究發(fā)現(xiàn)在Zn2+（1 mmol·L-1）、Ca2+（1 mmol·L-1）和Co2+（1 mmol·L-1）存在條件下，CDA的活性會增強。將釀酒酵母的一種CDA去糖基化會導(dǎo)致酶幾乎全部活性喪失，通過補加1 mmol·L-1Co2+能夠恢復(fù)酶的活性，但其他金屬離子則不具備這一作用[30]。類似地，EDTA能使擔(dān)子菌類金針菇的CDA活性喪失，補加1 mmol·L-1的Co2+能使酶的活力恢復(fù)[31]。本研究表明Mg2+、Zn2+、Mn2+和Ca2+對HcCDA1和HcCDA2酶促反應(yīng)整體呈抑制趨勢；隨著濃度增大，Zn2+對HcCDA1抑制作用逐漸增強，而Mg2+對HcCDA1的抑制作用則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而且Mg2+、Ca2+對HcCDA2的抑制作用也是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。Co2+和Fe2+對HcCDA1和HcCDA2酶促反應(yīng)有激活作用，隨著濃度增大，F(xiàn)e2+激活作用越強，而Co2+激活作用則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。Tokuyasu等[32]研究發(fā)現(xiàn)在菜豆炭疽病菌（）中加入Cu2+能抑制CDA的活性，可以將含銅的殺菌劑應(yīng)用于這種病原菌的防治。由此推測，上述某種金屬離子可能作為設(shè)計環(huán)境友好型殺蟲劑的添加劑，用于害蟲的生物防治。

當(dāng)前對I類CDA的研究主要集中在基因水平，對該類基因進行重組表達以及對其蛋白性質(zhì)進行研究的報道較少。而I類CDA如何通過酶催化反應(yīng)實現(xiàn)幾丁質(zhì)的脫乙酰基是其參與昆蟲蛻皮過程幾丁質(zhì)裝配的關(guān)鍵，本研究對上述問題進行了基本的闡釋，有助于進一步研究幾丁質(zhì)脫乙酰酶基因在美國白蛾生長發(fā)育過程中的作用。

4 結(jié)論

獲得了美國白蛾幾丁質(zhì)脫乙酰酶2基因（）全長cDNA序列，能夠在原核細(xì)胞中表達61 kD目的蛋白，免疫家兔獲得HcCDA2蛋白的 特異性抗體。和在昆蟲細(xì)胞中 均成功表達約80 kD蛋白，且均檢測到催化活性，兩種酶的最適反應(yīng)溫度均為50℃，最適pH均為8.0。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Cloning, expression and enzymatic characterization of chitin deacetylases from

YAN Xiaoping1, ZHAO Dan1, GUO Wei1,2, WANG Wei1, ZHANG YaKun1, GAO YuJie1, ZHAO KunLi1

(1College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Baoding 071000, Hebei;2Plant Science and Technology College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206)

【Objective】 The objective of this paper is to study the function of the enzyme in the process of insect life, enzymatic characterization of chitin deacetylases fromand to provide a basis for understanding of its function in the insect life, and to provide new targets for the biological control strategy of. 【Method】 The conserved domain of chitin deacetylase 2 sequences from three kinds of lepidoptera insects,andwere analyzed and chitin deacetylase gene-specific primers were designed by homologous alignment. A cDNA clone was identified to contain cDNA sequence coding for chitin deacetylase by PCR amplification. The prokaryotic recombinant expression vector pET30a-was constructed and cloned in, the protein expression was induced by IPTG and detected by SDS-PAGE electorphoresis. The recombinant baculovirus expression vector pFastBac-and pFastBac-were constructed, and liposome transfection method was used to transfect insect cells Hi5, then the P1, P2 and P3 viruswere obtained, respectively. The P3 cells supernatant were collected and western blot analysis was applied to detect the chitin deacetylase 1 (from the previous study) and 2 protein expression. The recombinant proteins were crude purified with ammonium sulfate and then the enzymatic characterizations were studied with the 4’-nitroacetanilide (including the optimum temperature, the optimum pH and the effects of different metal ions on enzyme activity).【Result】 The full-length cDNA clone encoded chitin deacetylase 2 inwas identified (GenBank accession number: KT781841). The cDNA is 1.6 kb in length. The protein encoded by this cDNA is named HcCDA2 and the protein was shown a band on the SDS-PAGE gel with an apparent molecular weight of 61 kD. The specific antibodies reacting to HcCDA2 were obtained by immunizing rabbits. Theandwere shown as 80 kD proteins in Hi5 cell line detected by Western blot analysis. The study of enzymatic properties showed that the two enzymes which were secreting expression in insect cells possessed catalytic activity, and the optimum temperature were both 50℃, when the temperature reached 80℃, the HcCDA2 almost lost its activity; HcCDA1 enzymatic reaction appropriate pH ranged from 7.0-9.0, and the optimum pH of HcCDA1 and HcCDA2 were both 8.0. Under the optimum reaction conditions, the enzyme activities of HcCDA2 protein were higher than HcCDA1 protein. Mg2+, Zn2+, Mn2+and Ca2+showed an inhibition on HcCDA1 and HcCDA2, an increasing Zn2+concentration would lead to the enhancement of inhibitory effects on HcCDA1, but Mg2+showed a trend of increasing first and then decreasing on HcCDA1, as well as an increasing Mg2+or Ca2+concentration showed an inhibition on HcCDA2. Co2+and Fe2+showed activation on HcCDA1 and HcCDA2, Fe2+showed activation stably with increasing concentration, while Co2+showed a trend of increasing first and then decreasing. 【Conclusion】 The genewas cloned from, expressed inshown as a 61 kD protein, and the HcCDA2 protein-specific polyclonal antibodies were obtained by immunizing rabbits. The active HcCDA1 and HcCDA2 proteins were obtained, and both of them showed a catalytic activity, the optimum temperature and pH were both 50℃ and 8.0, respectively.

; chitin deacetylase; cloning and expression; enzymatic characterization

2016-10-12；接受日期：2016-12-05

國家自然科學(xué)基金（31471775）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（花生）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（30971910）、北京市百千萬人才工程項目

閆曉平，E-mail：1013479394@qq.com。通信作者郭巍，E-mail：1787421502@qq.com