吳楊，高慧純，張必弦，張海玲，王全偉，劉鑫磊，欒曉燕，馬巖松

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24-表油菜素內(nèi)酯對鹽堿脅迫下大豆生育、生理及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

吳楊1，高慧純1，張必弦3，張海玲2，王全偉1，劉鑫磊3，欒曉燕3，馬巖松3

(1哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/黑龍江省分子細(xì)胞遺傳與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150025；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所， 哈爾濱 150086；3黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究所，哈爾濱 150086）

【目的】探討外源EBR（24-表油菜素內(nèi)酯）對鹽堿復(fù)合脅迫下大豆的生長指標(biāo)、生理特性及超微結(jié)構(gòu)的影響，為改善大豆生長、保障糧食安全、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。【方法】以大豆品種黑農(nóng)44號為試材，分別在110 mmol·L-1的鹽堿復(fù)合脅迫條件下培養(yǎng)3 d和7 d進(jìn)行取材，研究1.2 mg·L-1外源EBR對大豆株高、根系生長，葉片3種抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）及抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，相對電導(dǎo)率、超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、游離脯氨酸和葉綠素含量以及葉片和根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響?！窘Y(jié)果】鹽堿脅迫處理3 d和7 d時，與對照組相比，3種抗氧化酶（SOD、POD、APX）的活性、游離脯氨酸含量、相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量均升高；各項生長指標(biāo)、葉綠素含量均降低；葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)中葉綠體和線粒體遭到嚴(yán)重破壞；根尖細(xì)胞中線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞較重，液泡破裂。鹽堿脅迫條件下，施加外源EBR使大豆的株高、根長和根鮮重分別提高了6.45%、9.60%和19.85%；使大豆葉片SOD、POD、APX的活性顯著升高，在3 d和7 d時分別增加了16.92%和9.68%、48.85%和61.44%、19.05%和20.36%；相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA的含量顯著降低，分別降低了19.58%和28.26%、28.06%和40.92%、28.62%和31.21%、31.03%和37.17%；脯氨酸和葉綠素含量顯著升高，分別升高了3.67%和15.96%、13.34%和16.87%；同時維護(hù)了大豆葉片和根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延緩了細(xì)胞的衰老、解體?！窘Y(jié)論】在鹽堿脅迫下，施加外源EBR通過提高抗氧化酶活性和脯氨酸及葉綠素含量，降低了活性氧（ROS）的積累，維護(hù)了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，促進(jìn)了幼苗生長，增強了大豆幼苗耐鹽堿脅迫的能力。

大豆；鹽堿脅迫；24-表油菜素內(nèi)酯；生育；生理特性；超微結(jié)構(gòu)

0 引言

【研究意義】由于氣候的不穩(wěn)定，以及不合理的灌溉，全球鹽堿地的面積正在日益擴大，不僅包括以NaCl為主的中性鹽，也包括以Na2CO3為主的堿性鹽[1]。鹽堿脅迫是一個主要的非生物脅迫，會導(dǎo)致滲透脅迫，離子毒害，妨礙植物對礦物質(zhì)營養(yǎng)素的吸收和攝取，損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，擾亂細(xì)胞的生理代謝，嚴(yán)重影響植物的生長、發(fā)育和生產(chǎn)力。植物根系最早感知鹽堿脅迫信號，導(dǎo)致根系生長受阻并引發(fā)一系列生理反應(yīng)，從而影響地上部生長狀態(tài)。短期鹽堿脅迫下，植物的光合作用、蛋白質(zhì)合成以及能量和脂質(zhì)代謝都會受到影響；長期暴露在鹽堿脅迫下會引起離子毒害，從而引起成熟葉片的早衰、變黃、壞死等[2]。大豆（）是植物蛋白和油脂的主要來源，但由于近些年來農(nóng)田土壤和水體鹽堿累積超標(biāo)問題日益嚴(yán)重，導(dǎo)致大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降。油菜素內(nèi)酯（brassinolide，BL）俗稱蕓苔素內(nèi)酯，是一種廣泛存在于植物中的類似動物甾醇類激素的天然化合物[3]，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)40余種BL類似物，統(tǒng)稱為油菜素甾類物質(zhì)（brassinosteroids，BRs）。現(xiàn)已被確定為調(diào)控植物生長發(fā)育的第六大關(guān)鍵激素，參與植物根和葉的細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長、光合作用、生殖發(fā)育、葉片的衰老等生理過程，能有效的減緩脅迫對植株的損傷[4]。因此，研究外源24-表油菜素內(nèi)酯（24-epibrassinolide，EBR）對鹽堿脅迫下大豆幼苗生理調(diào)節(jié)的作用以及對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】BR的生理活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有的5種激素，逆境脅迫下的植株經(jīng)低濃度的BR處理傷害便可以起到緩解作用。許多研究表明，BR在農(nóng)業(yè)上的潛在應(yīng)用是為了緩解多種生物和非生物脅迫對植株造成的氧化損傷，如干旱[5]、鹽[6]、極端溫度[6-7]、重金屬[8]和病菌侵染[9]等，改善植物的生長發(fā)育和提高產(chǎn)量，增強植株對逆境條件的耐受力。束紅梅等[10]研究表明，施加外源EBR可以提高棉花幼苗根和葉片在NaCl脅迫下根系活力及光合速率、增強抗氧化酶的活性，降低丙二醛（MDA）含量，減輕了膜脂過氧化程度。陸曉民等[11]研究發(fā)現(xiàn)，低氧脅迫下噴施EBR后黃瓜幼苗根系的線粒體抗氧化酶活性升高，超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）含量、丙二醛含量降低，根尖細(xì)胞受損害程度降低，從而減輕了鹽脅迫對植物造成的傷害?！颈狙芯壳腥朦c】鹽堿環(huán)境不利于作物的生長和繁殖，EBR對逆境脅迫下植物生長發(fā)育調(diào)節(jié)的研究越來越被關(guān)注，而EBR對鹽堿脅迫下大豆的生育、生理特性及其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響鮮有報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以黑農(nóng)44為試材，探討外源EBR在大豆響應(yīng)鹽堿脅迫中的生理調(diào)節(jié)功能和在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性中的作用，對提高大豆的鹽堿抗性具有重要的理論和實際意義，為改善大豆生長、保障糧食安全、實現(xiàn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗設(shè)計

試驗在哈爾濱師范大學(xué)日光溫室及中心實驗室進(jìn)行，選取黑龍江省農(nóng)科院大豆育種所提供的黑農(nóng)44號作為試驗材料。挑選籽粒飽滿，均勻一致的種子，經(jīng)5%的次氯酸鈉消毒后，用無菌水沖洗干凈。2016年4月18日將種子播種于蛭石中。子葉展平后每隔1天澆灌1次1/2Hoagland營養(yǎng)液。待幼苗生長至第三對三出復(fù)葉時，選取長勢基本一致的幼苗72株進(jìn)行試驗。試驗設(shè)置如下4組處理：

（A）CK：1/2Hoagland營養(yǎng)液（pH=7.74±0.087）+噴施蒸餾水；

（B）CK+EBR：1/2Hoagland營養(yǎng)液（pH=7.74± 0.087）+噴施1.2 mg·L-1EBR；

（C）XP：1/2Hoagland營養(yǎng)液+110 mmol·L-1的鹽堿混合溶液（NaCl﹕Na2SO4﹕NaHCO3﹕Na2CO3=9﹕1﹕9﹕1，pH=8.42±0.043）+噴施蒸餾水；

（D）XP+EBR：1/2Hoagland營養(yǎng)液+110 mmol·L-1的鹽堿混合溶液（NaCl﹕Na2SO4﹕NaHCO3﹕Na2CO3= 9﹕1﹕9﹕1，pH=8.42±0.043）+噴施1.2 mg·L-1EBR。

每個處理3盆，每盆6株，處理期間每隔1天更換營養(yǎng)液和噴施等量的蒸餾水或EBR，噴灑時要加入體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-20作為展開劑（含CK和XP）。按照試驗設(shè)計將1.2 mg·L-1EBR溶液及蒸餾水分別噴施于葉片正反面，以葉面濕潤不流滴為準(zhǔn)。

1.2 指標(biāo)的測定與方法

生長指標(biāo)的測定：取處理7 d的大豆幼苗，每種處理取樣18株，進(jìn)行生長指標(biāo)的測定，取其平均值。

生理指標(biāo)的測定：分別選取處理3 d后和7 d后的葉片進(jìn)行各項指標(biāo)的測定，試驗重復(fù)3次，測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、過氧化物酶（peroxidase，POD）活性、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性、相對電導(dǎo)率、超氧陰離子（O2-）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、游離脯氨酸含量、葉綠素含量的具體方法根據(jù)文獻(xiàn)[12]進(jìn)行。

1.3 電鏡樣品處理方法

處理7 d后，選取各處理新鮮成熟的葉片和根尖相同的部位，切取1—2 mm2的樣品，用2.5%戊二醛（pH7.5）冷固定液進(jìn)行固定并抽氣致使材料下沉為止，固定24 h，然后用磷酸緩沖液充分沖洗3次后，再用1.5%鋨酸固定4 h，然后用30%—100%梯度乙醇、丙酮脫水各15 min，用Epon812環(huán)氧樹脂進(jìn)行浸透包埋，然后加熱聚合，切片后用鈾和鉛雙重染色，在日立H-7650型透射電鏡下觀察葉片和根尖的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析

數(shù)據(jù)處理用SPSS軟件的Duncan’s多重比對法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Excel軟件進(jìn)行繪圖，并用不同的字母標(biāo)注差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆幼苗生長指標(biāo)的影響

由表1可知，與對照CK相比，CK+EBR處理組的各項生長指標(biāo)變化均不顯著。鹽堿脅迫處理后，大豆的株高、根長、根鮮重分別比CK降低了7.67%、13.12%和26.56%。說明在鹽堿脅迫條件下大豆幼苗的生長發(fā)育受到了嚴(yán)重的影響。與鹽堿脅迫處理相比，鹽堿脅迫+EBR處理能夠提高大豆的生長指標(biāo)，株高、根長、根鮮重分別增加了6.45%、9.60%和19.85%。說明外源EBR能夠緩解鹽堿脅迫對大豆幼苗生長的抑制，促進(jìn)大豆植株茁壯生長。

表1 鹽堿脅迫下施加外源 EBR 對大豆幼苗生長的影響

同列不同小寫字母表示處理間在 0.05水平差異顯著

Different small letters in the same column mean significant difference among treatment at the 0.05 level

2.2 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆葉片SOD、POD和APX活性的影響

由圖1可知，與對照CK相比,CK+EBR在處理3 d和7 d時3種酶活性變化均不顯著。鹽堿脅迫處理后，大豆葉片SOD、POD、APX活性均較CK顯著升高，在鹽堿脅迫處理3 d和7 d時，SOD、POD、APX活性分別比CK升高27.80%和35.25%、14.58%和23.78%、110.01%和137.32%，這是植物對脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)；與鹽堿脅迫處理相比，鹽堿脅迫+EBR處理顯著提高了3種抗氧化酶活性，在3 d和7 d分別增加了16.92%和9.68%、48.85%和61.44%、19.05%和20.36%。說明鹽堿脅迫下施加外源EBR可以顯著提高大豆的抗氧化酶活性，以增強大豆對逆境脅迫的耐受性。

不同小寫字母表示處理間在 0.05水平差異顯著，短線代表標(biāo)準(zhǔn)誤。下同

2.3 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆葉片相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的影響

由圖2可知，與對照CK相比，CK+EBR在處理3 d和7 d時4種生理指標(biāo)變化均不顯著。鹽堿脅迫處理后，大豆葉片相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量與CK相比顯著升高，處理3 d和7 d時，分別比CK增加了281.32%和340.65%、71.62%和214.06%、103.63和878.86%、101.87%和127.84%。與鹽堿處理相比，施加外源EBR可以降低大豆葉片相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量在脅迫3 d和7 d時分別降低了19.58%和28.26%、28.06和40.92%、28.62%和31.21%、31.03%和37.17%。說明EBR能顯著降低鹽堿脅迫下活性氧對大豆膜脂的氧化損傷。

2.4 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆葉片游離脯氨酸含量的影響

由圖3-A可知，與對照CK相比，CK+EBR在處理3 d和7 d時脯氨酸含量變化均不顯著。鹽堿脅迫處理使大豆葉片脯氨酸含量顯著升高，處理3 d和7 d時，分別較CK增加了18.28%和10.22%；與鹽堿脅迫處理相比，施加外源EBR均顯著提高了葉片游離脯氨酸含量，在3 d和7 d時分別提高3.67%和15.96%，說明EBR能夠促進(jìn)大豆體內(nèi)游離脯氨酸的合成。

2.5 外源EBR對鹽堿脅迫下大豆葉片葉綠素含量的影響

由圖3-B可知，與對照CK相比，CK+EBR在處理3 d和7 d時均無顯著差異。隨著時間延長，鹽堿和鹽堿+EBR處理的大豆幼苗葉片中葉綠素含量均呈下降的趨勢。鹽堿脅迫處理后，大豆葉片的葉綠素含量與CK相比顯著下降，處理3 d和7 d時，分別下降了9.60%和15.86%，說明鹽堿脅迫對大豆的光合系統(tǒng)會造成了損傷。與鹽堿脅迫處理相比，施加外源EBR能顯著提高大豆葉片葉綠素含量，在3 d和7 d分別增加了13.34%和16.87%，說明外源EBR可有效緩解鹽堿脅迫條件下葉綠素含量的降低，促進(jìn)植物進(jìn)行正常的光合作用。

圖2 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆葉片相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA含量的影響

圖3 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆葉片脯氨酸和葉綠素含量的影響

2.6 透射電鏡觀察結(jié)果

2.6.1 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆葉片細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 對照CK和CK+EBR處理的大豆葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)幾乎沒有差別（圖4-1A—圖4-8A），葉片細(xì)胞內(nèi)含有大量的葉綠體，這些葉綠體呈梭形緊貼于細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)，葉綠體雙層膜結(jié)構(gòu)完整且清晰，葉綠體基粒片層整齊有序，與葉綠體長軸近似平行，類囊體緊密排列而整齊；細(xì)胞核明顯，雙層核膜結(jié)構(gòu)清晰，核基質(zhì)、染色質(zhì)豐富；細(xì)胞中線粒體分布在葉綠體周圍，呈橢圓形或腎形，雙層膜結(jié)構(gòu)清晰，外膜平滑，內(nèi)膜向內(nèi)折疊成嵴，內(nèi)嵴豐富且清晰，內(nèi)含物多，說明細(xì)胞正處在生長旺盛階段。在鹽堿脅迫下，大豆葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化（圖4-9A—圖4-12A）。葉綠體明顯膨脹，葉綠體膜局部破裂，基粒片層膨脹、松散、模糊不清、排列扭曲、分布混亂；核仁變小，異染色質(zhì)增多；線粒體受到鹽堿脅迫損傷，內(nèi)嵴變少并且模糊不清，內(nèi)含物明顯減少。與鹽堿脅迫處理相比（圖4-13A—圖4-16A），施加外源EBR能有效緩解鹽堿脅迫對大豆細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使葉綠體、線粒體和細(xì)胞核的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持完整，與對照CK相比變化不大。

2.6.2 鹽堿脅迫下施加外源EBR對大豆根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 對照CK和CK+EBR處理的大豆根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)幾乎沒有差別（圖5-1B—圖5-6B），根尖細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)豐富，線粒體多且內(nèi)嵴清晰，內(nèi)含物多。鹽堿脅迫處理的根尖細(xì)胞結(jié)構(gòu)異常（圖5-7B—圖5-9B），個別大液泡消失，細(xì)胞質(zhì)紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)松散膨脹并最終解體，個別線粒體外膜模糊不清，內(nèi)嵴減少，內(nèi)含物減少。與鹽堿脅迫處理相比，施加外源EBR處理的大豆根尖細(xì)胞細(xì)胞器的損傷明顯得到了緩解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和大液泡結(jié)構(gòu)完整，與對照組相比變化不大（圖5-10B—圖5-12B）。

CW：細(xì)胞壁；M：線粒體；V：液泡；ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。1B—3B：根細(xì)胞CK組；4B—6B：根細(xì)胞CK+EBR組；7B—9B：根細(xì)胞XP組；10B—12B：根細(xì)胞XP+EBR組

3 討論

土壤鹽害能夠限制植物的生長和發(fā)育，是因為過多的Na+和Cl-打破了滲透勢的平衡，從而干擾營養(yǎng)物質(zhì)的積累、酶的結(jié)構(gòu)和活性，破壞細(xì)胞器和脂膜的完整，影響光合作用、呼吸作用以及蛋白質(zhì)的合成[13]。BR是一類甾醇類植物激素，能夠激發(fā)植物的內(nèi)在潛能，改善植物代謝，使作物的耐逆性增強，從而促進(jìn)作物的生長和產(chǎn)量的提高。由于BR具有多種生理效應(yīng)，因此，目前認(rèn)為它可能存在不止一個分子響應(yīng)機制，其中有2個重要的機制：（1）BR通過調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來控制不同酶的合成；（2）BR影響膜的特性。本研究表明，噴施EBR能夠緩解鹽堿脅迫對大豆生長的抑制，使大豆幼苗的株高、根長和根鮮重等較單純鹽堿脅迫時有所提高，說明EBR能夠促進(jìn)大豆植株生物量的積累，在大豆響應(yīng)逆境脅迫中起到了正向調(diào)節(jié)的作用，這與前人研究結(jié)果一致[9,11,14]。施加外源EBR減緩了鹽堿脅迫對大豆生長的抑制，可能是由于EBR調(diào)控了細(xì)胞分裂[15]、組織分化[16]、木質(zhì)部發(fā)育[17]及激素合成[18]過程中相關(guān)基因的表達(dá)、刺激光合作用[14]、增加植物對營養(yǎng)的吸收[19]等。

植物在正常的呼吸作用、光合作用和固氮作用過程中會產(chǎn)生有害的活性氧（ROS）[20]，如超氧化物自由基（O2-）、羥基自由基（OH-）、過氧化氫（H2O2）等。SOD、POD和APX是植物體內(nèi)ROS自由基清除系統(tǒng)的保護(hù)酶，能夠及時的清除機體內(nèi)有害的ROS，以解除其對作物造成的傷害[21]。逆境脅迫會損傷植物的抗氧化系統(tǒng)，打破ROS產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，造成活性氧在細(xì)胞內(nèi)大量積累，啟動膜脂過氧化作用[22]，導(dǎo)致MDA含量升高，膜通透性增大，電解質(zhì)外滲，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞，尤其是導(dǎo)致線粒體和葉綠體結(jié)構(gòu)的異常，進(jìn)而影響植物的光合作用和有氧呼吸，嚴(yán)重抑制植物的生長發(fā)育。BR能夠激活植物抗氧化系統(tǒng)的活性，降低逆境對細(xì)胞質(zhì)膜及亞顯微結(jié)構(gòu)的損傷，緩解逆境對植物的傷害[23-25]。本試驗結(jié)果表明，對鹽堿脅迫下的大豆幼苗施加EBR可以顯著降低相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA的含量，同時顯著的提高了SOD、POD和APX的活性。這與前人研究結(jié)果一致[26-27]。這說明外源EBR可以激活大豆的抗氧化酶活性，來抑制膜脂過氧化，防止離子滲漏，提高植物的氧化應(yīng)激性，降低活性氧對植物的損傷。BR介導(dǎo)植物對氧化脅迫的響應(yīng)可能是由于BR調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，如Xia等[28]研究表明EBR誘導(dǎo)了RBOH、MAPK1和MAPK3的表達(dá)，從而激活了抗氧化酶合成的代謝途徑，緩解了脅迫對植物的氧化損傷。Ding等[29]研究發(fā)現(xiàn)，EBR可以通過增加WRKY轉(zhuǎn)錄因子和防御相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，有效緩解枯萎病對植株的傷害。

鹽堿脅迫會改變植物的滲透平衡，導(dǎo)致細(xì)胞失水和滲透勢下降，植物體可通過自身的代謝活動積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持細(xì)胞膨壓。脯氨酸是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，鹽堿脅迫下植物體內(nèi)脯氨酸含量會迅速積累以提高植物的適應(yīng)性反應(yīng)[30-31]。脯氨酸除作為滲透調(diào)節(jié)物之外，還可通過清除活性氧自由基[32]、穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)[33]來提高植物對鹽堿脅迫的抵御能力。本試驗發(fā)現(xiàn)，噴施EBR能使脯氨酸含量較單純鹽堿脅迫時顯著升高，與螺旋藻[23]和綠豆[34]中的研究結(jié)果一致。在鹽堿脅迫下，脯氨酸含量的積累與其生物合成的限速酶吡咯啉-5-羧酸合成酶（pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS）和降解酶脯氨酸脫氫酶（proline dehydrogenase，PDH）有關(guān)[35]，推測EBR的作用機制可能是通過提高P5CS的活性或抑制PDH的活性，以提高細(xì)胞內(nèi)脯氨酸的積累量，緩解鹽堿脅迫對生物膜造成的損害。

葉綠素是植物的光合色素，存在于葉綠體類囊體薄膜上，在光合作用中參與光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)換作用。鹽堿脅迫會通過加速葉綠素的降解或抑制其生物合成而導(dǎo)致植物葉綠素含量下降[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照相比，鹽堿脅迫會造成大豆葉片的葉綠素含量顯著下降，這說明鹽堿脅迫可能改變了作用于葉綠素生物合成途徑酶的正常構(gòu)型。從而抑制了酶的活性，阻礙了葉綠素的合成。BR能夠提高多種逆境脅迫下植物的葉綠素含量，如冷[28]、高鹽[37]、干旱[37]、重金屬[37]等，從而調(diào)節(jié)光合作用，本試驗也得到了相似的結(jié)果，在鹽堿脅迫下，噴施EBR能夠顯著提高葉綠素含量，說明外源EBR能使鹽堿脅迫下大豆葉綠素含量維持較高水平，從而保證了植株的光合活性，加大了植株的生物量合成，使植株的株高、根長和根鮮重較單純鹽堿脅迫均有所增加。BR提高葉綠素含量的機制可能是由于誘導(dǎo)了決定葉綠素生物合成和光合酶活性的特定基因的表達(dá)[38]。

鹽堿脅迫對大豆細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響是多方面的，膜系統(tǒng)是植物鹽害的主要部位，最終會導(dǎo)致細(xì)胞相應(yīng)的生理功能降低[39-40]。本試驗通過對葉片和根尖超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫對葉綠體和線粒體的傷害最為明顯。本試驗結(jié)果顯示，鹽堿脅迫導(dǎo)致了葉片細(xì)胞中葉綠體膜破裂，基粒片層膨脹、排列紊亂，這必將干擾光合色素的含量，影響電子傳遞和卡爾文循環(huán)，降低了光合性能。同時還發(fā)現(xiàn)，鹽堿脅迫導(dǎo)致葉片細(xì)胞異染色質(zhì)增多、核仁變小，這可能會抑制某些基因的表達(dá)，影響了相關(guān)蛋白的合成速率，這些都與鹽堿脅迫造成的生物量下降密切相關(guān)。線粒體是活性氧產(chǎn)生和清除的主要場所，本試驗結(jié)果顯示，鹽堿脅迫導(dǎo)致了葉片和根尖細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，這必將損傷大豆的抗氧化系統(tǒng)，從而造成了細(xì)胞內(nèi)ROS的大量積累，膜透性增大，這與前人研究結(jié)果相一致[11,40-42]。本試驗中，噴施外源EBR減輕了鹽堿脅迫對大豆葉片和根尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的破壞，維護(hù)了細(xì)胞器膜系統(tǒng)的相對穩(wěn)定。這正可以用EBR促進(jìn)了鹽堿脅迫下大豆抗氧化系統(tǒng)酶活性的升高，減輕了活性氧對膜脂的傷害來解釋。這與陸曉民等[11]在低氧脅迫黃瓜幼苗施用EBR后，其幼苗根系線粒體抗氧化系統(tǒng)及其細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)均比單純處理有所緩解的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

鹽堿脅迫會限制植物的生長，影響植物的正常代謝，導(dǎo)致活性氧的積累和脂質(zhì)過氧化，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)。噴施EBR能顯著促進(jìn)大豆葉片游離脯氨酸的積累，提高葉綠素的含量，激活SOD、POD和APX 3種抗氧化酶的活性，降低葉片相對電導(dǎo)率、O2-產(chǎn)生速率、H2O2和MDA的含量，有效緩解細(xì)胞結(jié)構(gòu)，特別是葉綠體和線粒體膜系統(tǒng)的受損程度。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Effects of 24-Brassinolide on the Fertility, PhysiologicalCharacteristics and Cell Ultra-Structure of Soybean under Saline-alkali Stress

WU Yang1, GAO HuiChun1, ZHANG BiXian3, ZHANG HaiLing2, WANG QuanWei1, LIU XinLei3, LUAN XiaoYan3, MA YanSong3

(1College of Life Science and Technology, Harbin Normal University/Key Laboratory of Molecular Cytogenetics and Genetic Breeding of Heilongjiang Province, Harbin150025;2Institute of Grass Research, Heilongjiang Academy of Agriculture Sciences, Harbin150086;3Soybean Research Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150086)

【Objective】The aim of this experiment was to study the effects of exogenous EBR (24-epibrassinolide) on the growth indices, physiological characteristics and cellular ultrastructure of soybean under saline-alkali stress. 【Method】Soybean variety Heinong 44 was employed as the test material, and cultivated in 110 mmol·L-1nutrient solution saline-alkali stress treatments for 3 d and 7 d to investigate the effects of 1.2 mg·L-1exogenous EBR on the height and root growth, SOD, POD, and APX three kinds of antioxidant enzyme activities, relative electrical conductivity, superoxide anion (O2-) production rate, contents of hydrogen peroxide (H2O2) and malondialdehyde (MDA), free proline concentration content, chlorophyll content of soybean leaves and the responses of cellular ultrastructure of soybean leaves and root tips under saline-alkali stress. 【Result】Under the condition of saline-alkali stress dealing with 3 d and 7 d, compared to the control, the three kinds of antioxidant enzyme activities of SOD, POD, and APX, free proline content, relative electrical conductivity, O2-production rate, contents of H2O2and MDA all increased, the growth indices and chlorophyll content all decreased; the chloroplast and mitochondria cellular ultrastructure of soybean leaves suffered severe damages. The mitochondria and endoplasmic reticulum cellular ultrastructure of soybean root tips suffered severe damages, and vacuole was ruptured. Application of EBR under saline-alkali stress increased soybean plant height, root length, fresh mass of root by 6.45%, 9.60% and 19.85%, respectively. Application of EBR the activities of SOD, POD, and APX of soybean leaves in 3 d and 7 d treatments increased by 16.92% and 9.68%, 48.85% and 61.44%, 19.05% and 20.36%, respectively, relative electrical conductivity, O2-production rate, H2O2and MDA contents significantly decreased by 19.58% and 28.26%, 28.06% and 40.92%, 28.62% and 31.21%, 31.03% and 37.17%, respectively, free proline content and chlorophyll content significantly increased by 3.67% and 15.96%, 13.34% and 16.87%, respectively. At the same time, the stability of soybean leaves and root tip cell ultrastructure were maintained and the aging of cells and disintegration were delayed.【Conclusion】The results suggested that application of exogenous EBR under saline-alkali stress could increase the antioxidant enzyme activities, free proline concentration and chlorophyll content, reduce the accumulation of reactive oxygen species(ROS), maintain the cell structure integrity, promote seedling growth and resulting in improving the tolerance of soybean seedlings to saline-alkali stress.

soybean; saline-alkali stress; 24-epibrassinolide; fertility; physiological characteristics; cell ultra-structure

2016-08-01；接受日期：2016-10-31

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項（RC2013QN002103）、黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（12511154）、哈爾濱師范大學(xué)博士科研啟動基金（KGB200903）

吳楊，Tel：15645178212；E-mail：m15645178212@163.com。通信作者王全偉，Tel：13845057803；E-mail：wqw125@126.com