王玲玲，顧 盼，唐曉蓮，周康森,蔣鵬俊，吳勝昔

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

?

新城疫病毒分子生物學特性及檢測方法的研究進展

王玲玲，顧 盼，唐曉蓮，周康森,蔣鵬俊，吳勝昔

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

新城疫(ND)是一種雞和火雞急性、烈性、高度接觸性疾病，由新城疫病毒(NDV)引起，死亡率可達100%，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重經(jīng)濟危害，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須通報的動物疫病。在我國，新城疫的傳播雖然已得到了控制，但NDV隱性感染基因?qū)θ祟惞残l(wèi)生依舊存在一定影響。由此，加深NDV各蛋白的結(jié)構(gòu)及功能的研究、對現(xiàn)有的NDV檢測技術(shù)進行改進以及新的檢測技術(shù)平臺的開發(fā)對ND 的防御具有重要意義。主要對NDV各蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及檢測技術(shù)的進展進行了闡述，為臨床和科研工作者提供一定的參考。

新城疫病毒；檢測方法；結(jié)構(gòu)蛋白

新城疫(newcastle disease，ND)是由新城疫病毒引起的雞高度接觸性傳染病[1-2]，主要表現(xiàn)為漿膜黏膜出血、呼吸困難、下痢及神經(jīng)紊亂等[3-5]。ND傳播速度快、致死率高、接觸傳染性強、分布廣泛，對禽類養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重威脅，所以世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類傳染病[6]。新城疫病毒特別是高毒株，被認為是一種人畜共患病毒，其潛伏期約為48 h，主要引起急性結(jié)膜炎。雖然在哺乳動物中沒有感染的報道，也沒有人際傳播報道[7-9],但是由于新城疫病毒具有極高的變異能力，其防控和檢測一直都是研究的重點。隨著檢測方法的多樣化，如病毒的分離與鑒定[10]，血清學檢測(血清中和、酶聯(lián)免疫等)[11-12]，分子生物學診斷技術(shù)(RT-PCR、單克隆抗體、指紋圖譜等)[13]等的應用，新城疫的傳播得到了較好的控制。但是隨著新城疫病毒不斷變異，這些方法已不能滿足需求。因此，研究 NDV各蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，以及現(xiàn)有的檢測技術(shù)的改良，是目前新城疫防控工作的一個重點。

1 新城疫病毒的結(jié)構(gòu)

新城疫病毒(NDV)是一種RNA病毒，又稱APMV-1[14-15]。NDV為單股負鏈RNA病毒，基因組主要編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)閱讀框，分別為形成核衣殼復合體的磷蛋白(P) 、核衣殼蛋白(NP)、RNA聚合酶蛋白(L)和外部蛋白的融合蛋白(F)和血凝素/神經(jīng)氨酸酶(HN)、基質(zhì)蛋白(M)[16-17]，其中在病毒毒力、病毒免疫中具有重要作用，與病毒的免疫應答和致病性緊密相關[18]的囊膜糖蛋白是F和HN兩種蛋白。

1.1 F蛋白

F蛋白即融合蛋白，相對分子質(zhì)量較大，以纖突狀形式存在于NDV囊膜上，是NDV最重要的保護性抗原和毒力蛋白。F蛋白促進宿主細胞與病毒的融合，使病毒進入細胞內(nèi)進行復制。F蛋白以無活性的前體糖蛋白 F0的形式存在，當融合蛋白前體F0被切割時，F(xiàn)1亞基N端融合肽釋放出來，與其他融合肽相互作用，病毒包膜與細胞膜發(fā)生融合，病毒核衣殼隨之進入宿主細胞的胞質(zhì)內(nèi)，并在胞質(zhì)中進行轉(zhuǎn)錄和復制[19]從而引起感染。

1.2 HN蛋白

HN蛋白具有血凝素(HA)活性和神經(jīng)氨酸酶(NA)活性。 HA能與靶細胞表面的唾液酸受體結(jié)合，使病毒吸附于細胞表面，促使新生病毒從細胞膜上釋放出來，NA則能破壞、切除唾液酸受體[20]。若HN蛋白mRNA的5’非編碼區(qū)和第401、416和526位氨基酸出現(xiàn)缺失或發(fā)生突變，則新城疫病毒的致病力將會降低[21-22]。同時，HN蛋白還具有促進細胞融合的活性。

1.3 M蛋白

M蛋白為非糖基化蛋白，大量存在于病毒囊膜內(nèi)側(cè)面，在病毒的裝配過程中必不可少。M蛋白影響病毒的致病力，可抑制宿主細胞的免疫應答及調(diào)節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成。Yin R等[23]采用RNA干擾技術(shù)特異性沉默M基因的特異性堿基位點，使得病毒的自主復制能力降低。

1.4 NP蛋白

NP蛋白是組成核衣殼復合體的主要蛋白，與病毒的增殖密切相關[24]。NP蛋白有兩個功能域，若缺失了NP蛋白的C端，NP蛋白與模板RNA結(jié)合后則不能啟動基因組的正常復制。NP蛋白與M蛋白作用后，將RNA包裝進入病毒粒子中形成NP-RNA復合體，免疫原性強[25]，并能介導細胞免疫作用。

1.5 P蛋白

P蛋白能與L蛋白一起共同形成復合物，該復合物為病毒RNA聚合酶，其一方面能產(chǎn)生酶活性，調(diào)節(jié)病毒的合成；另一方面也可與未組裝的NP蛋白結(jié)合，進而形成復合物，既能激活病毒基因，也可阻止NP與病毒RNA的組裝。此外，P基因在轉(zhuǎn)錄過程中容易出現(xiàn)RNA編輯現(xiàn)象，形成V、W 2種非結(jié)構(gòu)蛋白。V蛋白影響病毒的組織嗜性，對干擾素有拮抗作用[26]。W蛋白對病毒生物活性也有不可忽略的作用[27]。

1.6 L蛋白

L蛋白是病毒基因組中最長的蛋白，具有識別和起始轉(zhuǎn)錄的作用，與NP和P蛋白共同參與RNA的復制和轉(zhuǎn)錄。秦紅剛等[28]借助RNA干擾技術(shù)特異性沉默L基因上的三個酶活性區(qū)域。發(fā)現(xiàn)當這3個區(qū)域的蛋白表達沉默時，病毒的復制受到抑制，說明在L蛋白發(fā)揮依賴RNA聚合酶的功能上，這3個區(qū)域具有重要作用。此外，有文獻報道發(fā)現(xiàn)L基因可影響NDV的復制能力[29]。

2 新城疫病毒的檢測技術(shù)

2.1 熒光定量 RT-PCR 技術(shù)

RT-PCR技術(shù)是通過經(jīng)熒光標記的特異性探針來跟蹤 PCR產(chǎn)物并進行實時檢測的一種定量分析方法。該方法不僅提高了檢測的靈敏度，而且可建立實時擴增曲線，真正實現(xiàn)了DNA定量，具有重要的意義。屈素潔等[30]利用構(gòu)建的陽性標準重組質(zhì)粒，主要檢測新城疫病毒核酸，實現(xiàn)了對NDV的定量檢測。謝芝勛等[31]設計了2對特異性引物，并同時設計了2條 TaqMan探針，建立了二重RT-PCR方法，能同時檢測這2種傳染病，其中尿囊液檢測的拷貝數(shù)可達1010/μL以上，臨床病料的拷貝數(shù)為2.13×108/μL～6.52×104/μL。該方法檢測靈敏度高、特異性強、快速且無污染，表明多重熒光定量PCR檢測技術(shù)更加適合于大批量檢驗。

2.2 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱為DNA微陣列，是近年來新興的一種檢測技術(shù)。該技術(shù)是在分子生物學和醫(yī)學診斷技術(shù)的基礎上發(fā)展起來的，以特異性核酸序列為探針，借助其序列信息進行測試、解讀和分析，能快速、準確地檢測多種病原體，且成本較低、操作簡單。耿捷等[32]設計的20met寡核苷酸探針芯片可進行病毒的大規(guī)模和快速檢測。陳鳳梅等[33]通過克隆構(gòu)建病原的重組質(zhì)粒，進行特異性擴增，將擴增產(chǎn)物進行點樣，再與待檢樣品中的RT-PCR產(chǎn)物進行雜交，檢測到的陽性雜交信號的靈敏度為PCE的104倍。此基因芯片同時檢測了禽流感病毒、新城疫病毒、雞病支原體等5種病原，具有較好的特異性和敏感性。

2.3 膠體金試紙

膠體金試紙將特異的抗體或抗原固定在硝酸纖維素膜上，利用毛細管作用，將樣品移動到另一端，與相應的抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在膠體金的作用下呈現(xiàn)一定的顏色，從而檢測抗原/抗體。李蓓蓓等[34]利用檸檬酸三鈉還原法成功制備膠體金顆粒，并標記NDV單抗和AIV單抗，發(fā)現(xiàn)復合型膠體金試紙靈敏度比HA提高8倍，與AIV未出現(xiàn)交叉反應，且可在10 min中內(nèi)完成這2種病毒的檢測，其特異性、靈敏度以及穩(wěn)定性均達到了理想水平，且大大地節(jié)省了時間。對于現(xiàn)場快速NDV檢測，膠體金試紙是非常適合的檢測手段。

2.4 免疫熒光微球技術(shù)

免疫熒光微球直徑在納米到微米范圍內(nèi)，表面附有熒光物質(zhì)，一旦受到外界能量刺激能激發(fā)出熒光。此方法分析速度快、靈敏度高、特異性強,且樣品用量少[35]。楊麗麗等[36-37]利用流式微球為載體，將微球與單抗、抗原、多抗和熒光抗體結(jié)合形成雙抗夾心微球復合物，建立了NDV和AIV初步檢測方法。檢測結(jié)果表明：該微球復合物不與雞傳染性支氣管炎、雞痘病毒等發(fā)生交叉反應，特異性實驗、重復性實驗和敏感性實驗結(jié)果均較好，且與傳統(tǒng)的ELIS方法有良好的相關性。

3 結(jié)束語

近年來隨著禽類新城疫疫情的發(fā)生、發(fā)展及新的病毒基因型的出現(xiàn)，傳統(tǒng)的血清學檢測方法由于工作量大、檢測時間長已不能滿足其檢測要求，所以更加高效且節(jié)約時間的檢測方法仍需不斷探索，特別是對NDV的蛋白組學及基因組學的基本結(jié)構(gòu)的深入探究。只有更進一步的了解NDV基因組結(jié)構(gòu)和功能,才能制定出更好的檢測技術(shù)及防控措施。對于基層單位，可以采取便于操作、設備要求低、成本低、準確性高的檢測方法，如多重RT-PCR、膠體金試紙等；而對于大批量的檢測，則可以選擇生物芯片、熒光定量RT-PCR等效率高、穩(wěn)定性強、靈敏度高的檢測方法。因此,下一步ND防控工作的重點將會是研究更加高通量、快速、便捷的病毒強弱毒株分離鑒別檢測技術(shù)。

[1] 王志亮,劉華雷.新城疫[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2012.

[2] ALEXANDER D J.Gordon Memorial Lecture.Newcastle disease[J].Br Poult Sci,2001,42(1):5.

[3] ALDOUS E W,ALEXANDER D J.Detection and differentiation of Newcastle disease virus (avian paramyxovirus type 1)[J].Avian Pathology,2001,30(2):117-128.

[4] KE G M,LIU H J,LIN M Y,et al.Molecular characterization of Newcastle disease viruses isolated from recent outbreaks in Taiwan[J].Journal of Virological Methods,2001,97(1/2):1-11.

[5] LIN M Y,LIU H J,KE G M.Genetic and antigenic analysis of Newcastle disease viruses from recent outbreaks in Taiwan[J].Avian Pathology,2003,32(4):345-350.

[6] OIE.Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals:mammals,birds and bees.Biological Standards Commission[EB/OL].[2015-10-12].http://www.oie.int/en/international-standard-setting/terrestrial-manual/access-online/.

[7] CUADRADO-CASTANO S,SANCHEZ-APARICIO M T,GARCíA-SASTRE A,et al.The therapeutic effect of death:Newcastle disease virus and its antitumor potential[J].Virus Research,2015,209:56-66.

[9] 金寧一，蒯中明，馮書章，等．新編人獸共患病學[M]．北京：科學出版社,2007:345-358.

[10]崔榮華,仲劍,繆曉斌.新城疫病毒的分離與鑒定[J].農(nóng)家之友(理論版),2011(1):61-62.

[11]劉健宏,王標,莊向生,等.單克隆抗體與免疫熒光染色技術(shù)[J].福建畜牧獸醫(yī),2001(23):13-14.

[12]ALEXANDER D J,MANVELL R J,LOWINGS J P,et al.Antigenic diversity and similarities detected in avian paramyxovirus type 1 (Newcastle disease virus) isolates using monoclonal antibodies[J].Avian Pathology Journal of the W.v.p.a,1997,26(2):399-418.

[13]包靜楠,王金亮,唐慶冬,等.新城疫分子生物學診斷技術(shù)的研究進展[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2012(17):33-35.

[14]習有祥.禽病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社， 2008:72-74.

[15]BERINSTEIN A,VAZQUEZ-ROVERE C,ASURMENDI S,et al.Mucosal and systemic immunization elicited by Newcastle disease virus (NDV) transgenic plants as antigens[J].Vaccine,2005,23(48/49):5583-5589.

[16]PEETERS B P H,GRUIJTHUIJSEN Y K,LEEUW O S D,et al.Genome replication of Newcastle disease virus:involvement of the rule-of-six[J].Archives of Virology,2000,145(9):1829-1845.

[17]PHILLIPS R J，SAMSON A C，EMMERSON P T．Nucleotide sequence of the 5′-terminus of Newcastle disease virus and assembly of the complete genomic sequence：agreementwith the”rule of six”[J]．Arch Virol，1998，143(10)：1993-2002.

[18]ZHUHUI H,ARUNA P,SUBBIAH E,et al.The hemagglutinin-neuraminidase protein of Newcastle disease virus determines tropism and virulence.[J].Journal of Virology,2004,78(8):4176-4184.

[19]GRAVEL K A,MCGINNES L W,JULIE R,et al.The transmembrane domain sequence affects the structure and function of the Newcastle disease virus fusion protein.[J].Journal of Virology,2011,85(7):3486-3497.

[20]王青,張改平,趙森林,等.雞新城疫病毒分子生物學特性及檢測方法研究進展[J].河南農(nóng)業(yè)科學,2007,36(5):114-116.

[21]YONGQI Y,ROUT S N,SHIN-HEE K,et al.Role of Untranslated Regions of the Hemagglutinin-Neuraminidase Genein Replication and Pathogenicity of Newcastle Disease Virus[J].Journal of Virology,2009,83(11):5943-5946.

[22]KHATTAR S K,YAN Y,PANDA A,et al.A Y526Q mutation in the Newcastle disease virus HN protein reduces its functional activities and attenuates virus replication and pathogenicity[J].Journal of Virology,2009,83(15):7779-7782.

[23]YIN R,ZHUANG D,LIU X,et al.Inhibition of Newcastle disease virus replication by RNA interference targeting the matrix protein gene in chicken embryo fibroblasts[J].Journal of Virological Methods,2010,167(1):107-111.

[24]丁鏟.新城疫病毒核衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[J].中國預防獸醫(yī)學報,2011,33(1):80-84.

[25]RAHA A R,ABDUL MANAF A,SIANG T W,et al.Localization of the antigenic sites of newcastle disease virus nucleocapsid using a panel of monoclonal antibodies[J].Research in Veterinary Science,2009,86(1):174-182.

[26]ALAMARES J G,ELANKUMARAN S,SAMAL S K,et al.The interferon antagonistic activities of the V proteins from two strains of Newcastle disease virus correlate with their known virulence properties[J].Virus Research,2010,147(1):153-157.

[27]NOBUKO W,KING D J,SEAL B S,et al.The pathogenesis of Newcastle disease:A comparison of selected Newcastle disease virus wild-type strains and their infectious clones[J].Virology,2006,353(2):333-343.

[28]秦紅剛,劉丹.靶向新城疫病毒L基因(功能區(qū))的siRNA抑制新城疫病毒的復制[J].中國預防獸醫(yī)學報,2008,30(8):579-583.

[29]ROUT S N,SAMAL S K.The Large Polymerase Protein Is Associated with the Virulence of Newcastle Disease Virus[J].Journal of Virology,2008,82(16):7828-7836.

[30]屈素潔，梁媛，韋顯凱,等.熒光定量 RT-PCR 檢測雞新城疫病毒方法的建立及應用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2014(3):19- 21.

[31]謝芝勛,謝麗基,劉加波,等.禽流感和新城疫病毒二重熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].生物技術(shù)通訊,2008,19(3):410-413.

[32]耿捷,羅衛(wèi),林苗,等.基因芯片技術(shù)檢測新城疫病毒[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2004(12):72-73.

[33]陳鳳梅,吳時友,尹燕博,等.雞呼吸道傳染病基因芯片診斷方法的建立[J].畜牧獸醫(yī)學報,2005,36(12):1358-1362.

[34]李蓓蓓,薛強,李錦豐,等.新城疫病毒和禽流感病毒復合型膠體金免疫層析試紙條的制備[J].畜牧與獸醫(yī),2009,41(8):33-37.

[35]汪地強,劉白玲,胡杰,等.熒光微球的制備及應用[J].高分子材料科學與工程,2004,20(4):42-45.

[36]楊麗麗,王振國,王明泰,等.新城疫病毒流式微球免疫檢測新方法[J].分析化學,2008,36(1):29-33.

[37]楊麗麗,王曉娥,李占東.應用熒光微球檢測禽流感病毒的初步研究[J].天津農(nóng)業(yè)科學,2015,21(8):31-33.

(責任編輯 劉 舸)

Molecular Biology Characteristics and Detection of Newcastle Disease Virus

WANG Ling-ling, GU Pan, TANG Xiao-lian, ZHOU Kang-sen,JIANG Peng-jun, WU Sheng-xi

(College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology,Chongqing 400054,China)

Newcastle disease is an acute, potent and highly contagious disease in chickens and turkeys, which are caused by Newcastle disease virus (NDV), and the mortality rate will be up to 100 percent after infected NDV. It has brought serious economic harm to the poultry industry, and has been listed as mandatory animal diseases by the World Organization for Animal Health (OIE). In china, although the spread of Newcastle disease had been under control, the latent infection gene of Newcastle disease virus still caused some impact for human health. Therefore, it is very important to study the structure and function of each NDV protein, to improve the existing detection and to develop a new detection technology platform. The structure, function and detection technology of Newcastle disease virus protein were described, which would provided reference for clinical and scientific researchers.

newcastle disease virus; detection method; structural protein

2017-01-12

重慶高校優(yōu)秀成果轉(zhuǎn)化資助項目(KJZH14212)

王玲玲(1989—)，女，河南人，碩士研究生，主要從事疫苗與診斷技術(shù)研究；通訊作者 吳勝昔(1974—)，男，安徽人，博士，教授，主要從事疫苗與診斷技術(shù)研究。

王玲玲,顧盼，唐曉蓮，等.新城疫病毒分子生物學特性及檢測方法的研究進展[J].重慶理工大學學報(自然科學)，2017(4):95-99.

format：WANG Ling-ling, GU Pan, TANG Xiao-lian, et al.Molecular Biology Characteristics and Detection of Newcastle Disease Virus[J].Journal of Chongqing University of Technology(Natural Science)，2017(4):95-99.

10.3969/j.issn.1674-8425(z).2017.04.015

S852.65

A

1674-8425(2017)04-0095-05