莫方靜，李孟潔，柴雅琴，袁 若

（西南大學化學化工學院，重慶 400715）

0 前言

光致電化學(PEC)分析方法是基于光電化學現(xiàn)象而發(fā)展起來的[1]。它的原理可以簡單表述為光電材料在接受不同波長的光照射時，電子獲得能量，受到激發(fā)，通過電子調節(jié)機理將激發(fā)態(tài)電子轉移至半導體電極的導帶或是其它具有較低能量水平的能帶上，由此產生光電流[2]。PEC分析方法恰恰是電化學發(fā)光(ECL)的逆過程，光被用于激發(fā)電極上的活性物質，而各種波長的單色光很好獲得[3]。光生電流作為檢測信號，這樣比直接檢測光的強度更具穩(wěn)定性。PEC分析方法具有設備簡單、成本低廉、易于微型化和集成化等優(yōu)點。除此以外，PEC分析方法還具有令人滿意的靈敏度。很多研究者已經開始了對PEC分析方法的研究。PEC分析方法在各個領域都顯示出了廣闊的應用前景，如生物分析、醫(yī)藥行業(yè)、環(huán)境監(jiān)測、食品安全等[4]。

PEC分析方法運用范圍廣泛。就生物分析來說，PEC分析方法不愧為一種新興的，有前途的方法[5]。在生物分析中，一般都運用PEC分析方法來構建一些高選擇性的傳感器，以此達到對目標物檢測的目的。古麗加瑪麗.艾爾肯等[6]研究了基于分子信標的光致電化學生物傳感方法。濟南大學的王衍虎等[5]利用PEC分析原理構建了小型化、低成本的自供能生物傳感器，并用于分析測定。張曉茹等[7]研究得到了免標記的光致電化學凝血酶(TB)傳感器。雖然科學家們對PEC分析方法進行了很多研究，但PEC分析方法的機理尚不十分明確。因此，對PEC分析方法做進一步的探究是很有必要的。

適體是一種寡核苷酸片段，它類似于抗體并同抗體一樣能結合特定的目標分子。適體作為分子識別物質，具有很多優(yōu)點，如：高特異性、高親和力、分子量小、穩(wěn)定性好、目標分子范圍廣、可體外篩選、可化學合成等[8]。將適體與生物傳感器檢測技術結合起來，便可研制出一系列適體傳感器[9]。目前，研究者們對適體傳感器表現(xiàn)出了濃厚的興趣，研究最為普遍的有熒光適體傳感器、電化學適體傳感器等幾種。相對于傳統(tǒng)的傳感器，適體傳感器具有獨特的優(yōu)點，比如具有高的靶向性和特異性等。適體傳感器在醫(yī)藥病理、食品藥品、環(huán)境監(jiān)測等領域有著廣泛應用。賈飛等[10]研究了基于氧化石墨烯材料的食源性致病菌適體傳感器；郭業(yè)民等[11]研究了測定牛奶中抗生素殘留的適體傳感器；李發(fā)蘭等[12]進行了用于檢測抗生素殘留的適體傳感器的研究。

納米材料一般是指尺寸在1～100 nm間的粒子，納米材料具有以下效應：(a)表面效應：納米材料直徑小，比表面積大，表面原子的活性高；(b)量子尺寸效應：當半導體納米材料的載流子在每個方向均受限時，其費米能級附近的電子能級會由體相材料的連續(xù)能帶過渡到分立結構的不連續(xù)的能級，在光學吸收譜上表現(xiàn)為從無結構的寬吸收過渡到具有結構的特征吸收；(c)小尺寸效應：當納米材料的尺寸大小比傳導電子的德布羅意波長更小或是相等時，周期性邊界將被破壞，材料的各種物化特性將被改變；(d)宏觀量子隧道效應：量子相干器件中的電荷以及磁通量、微粒的磁化強度可以穿越宏觀系統(tǒng)中的能壘并產生變化[13]。納米材料具有以上四種特殊的效應，因此在磁性材料、催化、電子材料、光學材料、醫(yī)藥及功能材料等方面具有廣泛應用。

二氧化鈦，分子式TiO2，是一種常溫下不溶于水和無機酸、堿的白色粉末。二氧化鈦是一種偏酸性的兩性氧化物，其化學性質十分穩(wěn)定，常溫下與硫化氫、二氧化硫等均不發(fā)生反應，但二氧化鈦卻具有非常令人滿意的光電活性和光催化性能[14]。納米二氧化鈦(TiO2NPs)是指三維結構中至少一維的尺寸在1～100 nm之間的二氧化鈦。TiO2NPs具有表面活性高、分散性好、磁性強、光催化活性高、光電活性優(yōu)良等特性[15]。由于具有以上優(yōu)良的性質，TiO2NPs運用廣泛。其中，在PEC分析方法中，TiO2NPs作為光電活性物質，對目標物的測定起到了重要作用。除此之外，TiO2NPs還在光催化、環(huán)境監(jiān)測、食品安全、醫(yī)藥衛(wèi)生和能源領域都有重要應用[16]。

凝血酶(TB)是一種絲氨酸蛋白質水解酶，能促進血液凝固，在凝血功能的調節(jié)上具有重要作用。凝血酶在癌癥的病理探究、早期預防及后期治療都有著十分重要的作用[17]。因此，設計一種準確、靈敏測定凝血酶濃度的傳感器具有重大意義[18]。該論文根據PEC分析方法的原理，以準確、靈敏檢測凝血酶濃度為目標，構建適體傳感器。將納米二氧化鈦作為光電活性物質，利用其優(yōu)異的光學性質和光電轉換特性，得到相對較大并且穩(wěn)定的光電流信號。加之將H2O2作為電子供體，使獲得的光生電流信號具有持續(xù)性。從而保證了所構建適體傳感器的準確度和靈敏度。實驗結果表明，該適體傳感器的PEC信號響應值與凝血酶濃度的對數(shù)成線性關系，線性范圍為0.01 pmol/L～10 nmol/L，檢測限為 3.33 fmol/L。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

儀器：光致電化學分析儀(荷蘭IVIUMSTAT公司)，CHI660E型電化學工作站 (上海辰華儀器公司)，S-4800掃描電子顯微鏡 (SEM)(日本東京Hitachi公司)，F(xiàn)A-2004AFA/JA系列電子天平(Metter Toledo公司)，SB-80超聲清洗機 (寧波新芝生物科技股份有限公司)，TGL-20M高速臺式冷凍離心機 (長沙湘儀離心機儀器有限公司)，移液槍(成都方舟科技開發(fā)公司)，三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GCE，Φ＝4 mm)為工作電極、Ag/AgCl(飽和KCl溶液)電極為參比電極、鉑絲為對電極。

試劑：鈦酸四丁酯 (C16H36O4Ti)、無水乙醇(CH3CH2OH)、冰醋酸(CH3COOH)、鹽酸(HCl)、氯金酸(HAuCl4)、過氧化氫(H2O2)、巰基己烷(HT)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、凝血酶(TB)、100 pmol/L 的 L-半胱氨酸(L-Cys)、100 pmol/L 癌胚抗原(CEA)、100 pmol/L 甲胎蛋白(AFP)，超純水(18．2 MΩ·cm)由Millipore 水純化系統(tǒng)制備，用 0．1 mol/L Na2HPO4、0．1 mol/L KH2PO4和 0．1 mol/L KCl混合制備 0．1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH7．0)，用 20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、 1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L KCl、1 mmol/L CaCl2混合配制的 Tris-HCl緩沖溶液(pH7．4)，凝血酶適體鏈(TBA)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，具體序列號如下：

TBA:5′-NH2-(CH2)6-GGT TGG TGT GGT TGG-3′

1.2 納米TiO2的制備

取25 mL鈦酸四丁酯緩慢加入到8．75 mL乙醇中，攪拌10 min后形成黃色溶液A。將1 mL冰醋酸和2．5 mL超純水加入到8．75 mL乙醇中，攪拌形成溶液B，再滴加HCl(調節(jié)至pH＜3)。將A以3 mL/min的速度滴入B中，隨即攪拌30 min，再在40℃水浴中加熱2 h，形成膠體溶液。將該膠體溶液置于60℃下干燥，即可獲得納米TiO2。再取0．2 g納米二氧化鈦(TiO2NPs)分散于10 mL水中，離心洗滌，超聲成均一的溶液。

1.3 PEC適體傳感器的構建

文章中所設計PEC適體傳感器的構建過程如圖 1。 首先，將玻碳電極(GCE)分別用 0．3 μm 和0．05 μm三氧化二鋁(Al2O3)粉在麂皮上反復地打磨拋光，用超純水沖洗界面，并依次用乙醇和超純水連續(xù)超聲清洗干凈。隨后，將10 μL TiO2NPs滴涂到上述玻碳電極(GCE)上，于37℃的烘箱中烘干成膜。然后將經TiO2修飾的電極置于1%的氯金酸溶液中，于-0．2 V恒電位下電化學沉積10 s，并用超純水淌洗，隨即在該電極上滴涂15 μL TBA孵育12～16 h。用超純水淌洗，再在該電極上滴加10 μL HT，在室溫下孵育40 min以封閉其非特異性結合位點，并將電極用超純水淌洗。最后在電極上滴涂20 μL不同濃度的TB，常溫放置40 min。

圖1 PEC適體傳感器制備過程示意圖Fig．1 The schematic diagram of the preparation process of this PEC aptasensor

PEC 測量：在 5 mL PBS 緩沖溶液（0．1 mol/L，pH7．0）和 50 μL H2O2的混合溶液中，選擇波長為460 nm的單色光進行PEC測量。激發(fā)光源由LED燈提供，在0．0 V電位下關-開-關10-20-10秒。

2 結果與討論

2.1 納米二氧化鈦的SEM表征

制備好納米二氧化鈦后，經透射電子顯微鏡SEM照樣(圖2)。照樣結果顯示，制得的納米二氧化鈦成圓球狀，粒徑約為300 nm，結果表明圓球狀納米二氧化鈦已被成功制備。

圖2 納米二氧化鈦的SEM表征Fig．2 SEM characterization of TiO2NPs

2.2 PEC適體傳感器制備過程的電化學表征

通過測定被修飾電極在濃度為5 mmol/L的鐵氰化鉀溶液中的循環(huán)伏安(CV)強度變化來表征電極的制備過程，如圖3所示。a曲線是裸電極(GCE)的CV表征曲線，它表現(xiàn)為一對對稱的氧化還原峰。由于二氧化鈦納米粒子的導電性不好，相對于裸電極來說，CV表征的信號會減弱 (b曲線)。由于金納米粒子可以促進電子傳遞，所以當在電極上沉積納米金后，CV表征的信號增強(c曲線)。但當凝血酶適體鏈TBA修飾到電極表面上時，TBA帶負電，而氧化還原探針CN-也帶負電，同種電荷相互排斥，所以CV表征的信號與c曲線相比減弱了(d曲線)。接著用HT封閉，HT不導電，且HT與電極表面非特異性吸附位點結合，進一步阻礙電子的傳遞，CV信號再次降低 (e曲線)。最后，將凝血酶孵育在電極表面時，凝血酶會與凝血酶適體鏈特異性結合，再次阻礙電子的傳遞，因此CV信號進一步減弱(f曲線)。結果表明，該適體傳感器的每一步修飾過程都是成功的。

圖3 PEC適體傳感器制備過程的CV表征:(a)裸電極，(b)納米二氧化鈦/裸電極，(c)沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(d)凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(e)巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(f)凝血酶/巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極Fig.3 CV responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2NPs/bare GCE,(c)dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(d)TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(e)HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(f)TB/HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE

2.3 PEC適體傳感器制備過程的PEC表征

在 5 mL PBS緩沖溶液 (0.1 mol/L，pH7.0)和50 μL H2O2的混合溶液中進行光電流測量。激發(fā)光源由LED燈提供，選擇波長為460 nm的單色光，在0.0 V電位下關-開-關10-20-10秒。在圖4中，與裸電極(a曲線)的PEC響應信號相比，經納米二氧化鈦修飾的電極具有較高的PEC信號(b曲線)；鍍金后，由于納米金遮擋住了納米二氧化鈦，納米二氧化鈦接受光照的效率降低，PEC信號降低(c曲線)；通過Au-N鍵作用，將TBA成功地固載到Au修飾的電極上，PEC信號再次降低(d曲線)；經HT封閉住非特異性位點，PEC信號進一步降低(e曲線)；通過TB與TBA的特異性結合，將TB成功地固載到電極上，由于TB是一種蛋白，會阻礙電子的傳遞，因此PEC信號繼續(xù)降低(f曲線)。

圖4 適體傳感器制備過程的PEC表征:(a)裸電極，(b)納米二氧化鈦/裸電極，(c)沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(d)凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(e)巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極，(f)凝血酶/巰基己烷/凝血酶適體鏈/沉積金/納米二氧化鈦/裸電極Fig.4 PEC responses for each immobilized step:(a)bare GCE,(b)TiO2NPs/bare GCE,(c)dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(d)TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(e)HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE,(f)TB/HT/TBA/dep Au/TiO2NPs/bare GCE

2.4 光電流產生機理

光電流產生機理如圖5所示。利用納米二氧化鈦作為光電活性物質，納米二氧化鈦因為其特殊的納米結構而具有表面效應、量子尺寸效應、小尺寸效應和宏觀量子隧道效應。納米二氧化鈦具有優(yōu)異的光電活性，產生的光電流非常穩(wěn)定。當光源的能量大于納米二氧化鈦的禁帶寬度時，納米二氧化鈦價帶上的電子獲得能量、受到激發(fā)、躍遷到導帶上，電子從導帶上進一步轉移到電極的表面，同時底液中的電子供體H2O2向納米二氧化鈦的價帶提供電子，從而產生持續(xù)穩(wěn)定的光電流信號?；赑EC分析方法原理，利用納米二氧化鈦優(yōu)異的光電特性，構建了準確、靈敏的PEC適體傳感器。通過檢測PEC適體傳感器對不同濃度TB的PEC響應值，從而達到檢測TB濃度的目的。

圖5 光電流產生機理Fig.5 The generating mechanism of photocurrent

2.5 適體傳感器的PEC信號響應特性

采用標準直線法，用合理稀釋過的待檢測物凝血酶(TB)配置一系列不同濃度的樣品作為目標物，以測得適體傳感器對不同濃度凝血酶的光致電化學響應信號(圖6)。從圖6(A)中可以看到，適體傳感器對目標物凝血酶的PEC響應值隨凝血酶濃度的增加而降低，響應范圍為0.01 pmol/L～10 nmol/L，檢測限為3.33 fmol/L。表明基于半導體納米二氧化鈦的光致電化學適體傳感器實現(xiàn)了對凝血酶TB的靈敏檢測。圖6(B)為線性范圍內光致電化學峰電流值與lg cTB的線性相關圖，其線性方程為I=-82.2048 lgc+567.1205，相關系數(shù)r=0.9397。

圖6 適體傳感器對不同濃度TB的PEC響應圖(A)及校正曲線(B)(TB的濃度分別為:0.01 pmol/L,0.1 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L)Fig.6 PEC responses of different concentrations of target TB(A)and the corresponding calibration curve(the concentrations of target TB were 0.01 pmol/L,0.1 pmol/L,1 pmol/L,10 pmol/L,100 pmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L)

表1 PEC適體傳感器同其他測定凝血酶的方法對比[19-21]Tab.1 The PEC captasensor compared with other thrombin analytical methods

此外，將所構建的PEC適體傳感器的分析性能與其他檢測凝血酶(TB)的分析方法的分析性能進行對比。如表1所示，該論文所構建的適體傳感器具有相對較寬的線性范圍和相對較低的檢測限。這些結果進一步表明，該文所構建的適體傳感器對TB的定量檢測是可靠和靈敏的。

2.6 PEC適體傳感器的穩(wěn)定性

穩(wěn)定性是檢驗一個傳感器是否能得到實際應用的重要指標。一定濃度的待測物質在一定條件下的PEC信號是否穩(wěn)定，通過多次測量PEC信號求取偏差來衡量。利用該適體傳感器對濃度為100 pmol/L的凝血酶進行檢測，得到的PEC響應信號的相對標準偏差(RSD)為0.63%(圖7)。結果顯示，該傳感器具有較好的穩(wěn)定性，有望用于實際樣品的檢測。

圖7 PEC適體傳感器的穩(wěn)定性Fig.7 Stability of the PEC aptasensor

2.7 PEC適體傳感器的選擇性

為探索所構建適體傳感器的選擇性，該實驗用L-Cys、CEA和AFP作為干擾物質。在控制條件相同的情況下，在傳感器表面分別孵育L-Cys(100 pmol/L)，CEA(100 pmol/L)，AFP(100 pmol/L)和TB(10 pmol/L)。從圖8可以看出，孵育L-Cys、CEA和AFP的傳感器測得較高的PEC信號，并且與空白對照獲得的PEC信號相差不大。而孵育TB的傳感器測得較低的PEC信號，并且明顯低于這三種干擾物質。結果表明，該適體傳感器對凝血酶的檢測具有良好的選擇性。

圖8 PEC適體傳感器的選擇性Fig.8 Selectivity of the PEC aptasensor

2.8 加標回收實驗

為檢驗所構建的適體傳感器在實際應用中的可行性。用稀釋過50倍的健康人體血清分別配制以下濃度的凝血酶：5 nmol/L、1 nmol/L、20 pmol/L、5 pmol/L、0.1 pmol/L。 對樣品進行檢測，經過大量實驗，最終得到的結果如表2。由表可知，回收率在93.60%~104.00%之間，表明所構建的適體傳感器在健康人體血清中的檢測效果良好，有望用于實際樣品的檢測。

表2 PEC適體傳感器對不同濃度TB的檢測Tab.2 Detection of different concentrations of TB by this PEC aptasensor

3 結論

文章旨在運用光致電化學分析技術構建一種準確靈敏的PEC適體傳感器，用于凝血酶的檢測。正是由于納米二氧化鈦的優(yōu)良光電特性，獲得了較高的PEC響應信號。由于凝血酶適體鏈TBA對凝血酶TB的特異性識別，該適體傳感器具有良好的選擇性。該適體傳感器制備簡單、檢測靈敏、穩(wěn)定性好、選擇性高，提供了一種快速、準確測量凝血酶的檢測方案。在實際樣品中的檢測顯示，該適體傳感器對凝血酶的檢測有著較好的回收率，在臨床診斷中有著廣闊的發(fā)展前景和潛在的應用價值。

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