馮義驍,王 存

（1.西南大學(xué)附屬中學(xué)，重慶400700）（2.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶400065）

0 引言

山海棠素（Triptophenolide）又名雷酚內(nèi)酯，屬山海棠素型二萜類(lèi)生物堿成分，在衛(wèi)矛科植物昆明山海棠(Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch)中含量較高，具有抗炎、抗腫瘤，免疫抑制的生物活性作用，是治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的重要成分之一[1-3]。昆明山海棠分布在長(zhǎng)江流域、西南和東北等地區(qū)[4]，在臨床治療中常用于治療自身免疫性疾病[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)昆明山海棠在肝、腎、腸胃、生殖系統(tǒng)等多個(gè)部位有明顯的損害[7-9]，山海棠素也是其中的毒性成分[10-11]，因此，該文以昆明山海棠中山海棠素為研究目標(biāo)，分析其在動(dòng)物體內(nèi)的生物代謝過(guò)程，該研究對(duì)其臨床應(yīng)用和生物毒性研究具有積極意義。

隨著高分辨質(zhì)譜的快速發(fā)展，質(zhì)量虧損過(guò)濾（MDF）技術(shù)在數(shù)據(jù)挖掘，非目標(biāo)化合物篩查，藥物代謝及天然產(chǎn)物鑒定等方面具有越來(lái)越大的應(yīng)用空間。借助超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC/Q-TOF-MS)技術(shù)，分析中藥復(fù)雜成分和中藥的代謝，能夠在省略分離純化過(guò)程的同時(shí)鑒定痕量藥物及代謝物，同時(shí)，在藥物代謝物篩選與表征過(guò)程中，具有去除背景離子干擾，排除假陽(yáng)性，提高效率等諸多明顯優(yōu)勢(shì)。該研究以小鼠血漿中山海棠素的代謝為目標(biāo)，采用高分辨質(zhì)譜，基于多重質(zhì)量虧損和動(dòng)態(tài)背景扣除技術(shù)，系統(tǒng)分析了山海棠素在小鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，為中藥昆明山海棠的臨床使用及相互作用研究提供一定參考。

1 材料

TripleTOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng) （美國(guó)ABSCIEX公司）；LC-30AD超高效液相系統(tǒng) （日本SHIMADZU公司），R21G型高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；Elix10超純水凈化系統(tǒng) （美國(guó)MILLIPOER公司）；XS-105十萬(wàn)分之一精密電子天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）。

山海棠素(Triptophenolide,南昌貝塔生物科技有限公司 批號(hào)：20282-201602）,甲酸(Formicacid,Sigma-Aldrich公司，批號(hào)56302-10ML),水、乙腈、甲醇均為質(zhì)譜純(美國(guó)Fisher公司)。

2 方法

2.1 提取方法[12-15]

稱(chēng)取昆明山海棠藥材粉末0.1 g，置于25 mL容量瓶中，取95%的乙醇溶液20 mL于容量瓶中，超聲30 min放冷后定容，取1 mL于EP管中，10000 xg離心10 min，取上清液3 μL進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC/Q-TOF-MS分析。稱(chēng)取昆明山海棠藥材粉末3.0 g，取95%的乙醇溶液20 mL浸泡6 h，95%乙醇回流提取3次，每次4 h，合并乙醇提取液后回收乙醇即得乙醇浸膏。

2.2 昆明山海棠提取物給藥[16]

取18～20 g昆明小鼠12只(重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物編號(hào)SCXK(渝)2012-0006),雌雄各半,分為A、B兩組,飼養(yǎng)3 d后禁食12 h,自由飲水。A組灌胃同體積的生理鹽水作為空白對(duì)照，B組按照20 g(生藥)/kg(體重)劑量灌胃，A、B兩組分別于給藥后60 min取全血于肝素鈉化的EP管中，10000 xg離心10 min取血漿備用。

2.3 樣品采集與處理[17-19]

精密吸收小鼠血漿樣品 200 μL置 1.5 mL EP管中，加入甲醇600 μL后于渦旋液體混合器上混勻2 min，以10000 xg離心10 min，分別吸取上清液和空白對(duì)照液3 μL進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC/Q-TOF-MS分析。

2.4 色譜與質(zhì)譜條件[20]

超高效液相檢測(cè)條件：系統(tǒng)選用Kinetex XB-C18 柱 (100×2.1 mm，2.6 μm)， 流動(dòng)相為含0.1%甲酸的超純水(A)一乙腈(B)，采用梯度洗脫程序：起始B為10%并持續(xù)1.00 min；1.00～8.00 min B變?yōu)?0%，并持續(xù)至12.00 min；12.01 min B變?yōu)?0%并持續(xù)至15.00 min。流速為300 μL/min；柱溫為30℃。

TripleTOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)采用ESI離子源，采用Positive離子化方式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1000；鞘氣為 55 Psi，輔助氣為 55 Psi；氣簾氣為25 Psi，霧化溫度600℃，采用TOF-MSProductIon-IDA掃描模式，TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描ProductIon-IDA離子累積時(shí)間分別250，100 ms，采用多重質(zhì)量虧損(MMDF)和動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)作為二級(jí)觸發(fā)條件，解簇電壓80 V，CE碰撞能量為35 eV，CES碰撞能量疊加為(35±15)eV。

3 結(jié)果與討論

3.1 昆明山海棠提取物中山海棠素的MS分析

采用UPLC/Q-TOF-MS對(duì)山海棠素標(biāo)準(zhǔn)品和昆明山海棠提取物進(jìn)行分析。山海棠素精確分子量(m/z 313.1798)，山海棠素標(biāo)準(zhǔn)品在7.841 min出峰 (如圖1A),昆明山海棠提取物在7.846 min處有響應(yīng)(如圖1B)，進(jìn)一步對(duì)其MS/MS碎片進(jìn)行分析(如圖2A、2B)，判斷昆明山海棠提取物中含有山海棠素。

如圖2A和2B所示，山海棠素在ESI＋Positive模式中的母離子為m/z 313.1803[M+H]+，經(jīng)電離作用脫去異丙基和水分子后存在碎片m/z 253.1234，以及脫去羰基的m/z 225.1273。m/z 195.0805和m/z 183.0807是在m/z 225.1273的碎

圖1 山海棠素標(biāo)準(zhǔn)品和提取物中山海棠素的提取離子流圖Fig.1 The extracted ion current(XIC)spectra of Triptophenolide and extract ive in positive ion mode A The XIC spectra of Triptophenolide；B The XIC spectra of extractive

圖2 山海棠素標(biāo)準(zhǔn)品的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.2 The MS and MS/MS spectra of Triptophenolide in positive ion mode A The MS spectra of Triptophenolide；B The MS/MS spectra of Triptophenolide

3.2 昆明山海棠提取物在小鼠體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化分析

小鼠昆明山海棠提取物灌胃60 min后，血漿樣品中產(chǎn)生明顯代謝產(chǎn)物，如圖3所示。

3.3 山海棠素在小鼠體內(nèi)代謝物分析

山海棠素在小鼠體內(nèi)經(jīng)氧化和甲基化后產(chǎn)生m/z 343.1904的代謝物，分析推斷分子式為C21H26O4，質(zhì)量偏差0.1 mg/L，由于山海棠素結(jié)構(gòu)的特異性，氧化和甲基化不同的2,6,7位C原子的產(chǎn)物得到3種同分異構(gòu)體；山海棠素的1位C原子能被甲基化為m/z 327.1956質(zhì)量偏差為0.5 mg/L的代謝物，山海棠素的2、6、7位C原子皆能甲基化，所以有4個(gè)同分異構(gòu)體；6、7位C原子能被氧化形成兩個(gè)m/z分別為329.1742和329.1752的同分異構(gòu)體。內(nèi)水解—二氧化后產(chǎn)生m/z 363.1822的代謝產(chǎn)物，經(jīng)分析為C20H26O6，質(zhì)量偏差為5.4 mg/L，是山海棠素在小鼠體內(nèi)較為重要的代謝產(chǎn)物。山海棠素在小鼠體內(nèi)的代謝反應(yīng)多發(fā)生在1、2、6、7位C上，且代謝產(chǎn)物眾多，如表1所示。

圖3 給藥60 min后空白組和實(shí)驗(yàn)組血漿樣品的總離子流圖Fig.3 The TIC spectra of the plasma of blank and experimental group at 60 min in positive ion mode A The TIC spectra of blank group；B The TIC spectra of experimental group

表1 山海棠素在小鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物匯總Tab.1 The metabolites of biological transformation of triptophenolide in mouse

對(duì)昆明山海棠提取物中山海棠素在小鼠體內(nèi)的代謝物進(jìn)行系統(tǒng)分析后發(fā)現(xiàn)山海棠素在小鼠體內(nèi)經(jīng)過(guò)內(nèi)部水解、氧化、甲基化、氧化后甲基化、三氧化等多種轉(zhuǎn)化方式，形成系列相關(guān)代謝產(chǎn)物共26種，其生物轉(zhuǎn)化過(guò)程（如圖4）。

圖4 山海棠素在小鼠體內(nèi)代謝流程圖Fig.4 The flow diagram of biological transformation of triptophenolide in mouse

3.4 討論

該實(shí)驗(yàn)采用高分辨質(zhì)譜技術(shù)和MetabolitePilot代謝物分析鑒定軟件連用的方式，對(duì)昆明山海棠提取物中山海棠素在小鼠血漿中的生物代謝變化過(guò)程進(jìn)行分析。研究結(jié)果表明，山海棠素在小鼠體內(nèi)13位的異丙基和14位上的酚羥基容易斷裂，三個(gè)六元環(huán)為雷公藤二萜類(lèi)物質(zhì)活性基團(tuán)，呋喃環(huán)不是山海棠素的活性必要骨架結(jié)構(gòu)部分，所以呋喃環(huán)在小鼠血漿中的降解對(duì)山海棠素的生物活性沒(méi)有影響。

山海棠素作為昆明山海棠中有著良好臨床治療效果的二萜內(nèi)酯類(lèi)，其毒性藥理作用一直有待研究，并且少有文獻(xiàn)記載和報(bào)道，該次實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用考察小鼠體內(nèi)血漿中的山海棠素的毒性成分在血液中的變化情況來(lái)探究昆明山海棠的減毒增效作用機(jī)制，為改造山海棠素的結(jié)構(gòu)、提高臨床用藥安全性提供參考。

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