毛西京　羅翔丹　于挺敏

[摘要] 目的 觀察丁苯酞（NBP）對不同時間點血管性癡呆大鼠海馬組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白介素1β（IL-1β）表達的影響。方法 將80只健康Wistar大鼠按隨機區(qū)組法分為血管性癡呆模型（VD）組、血管性癡呆模型+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+VD）組、假手術+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+Sham）組和假手術（Sham）組4個組，每組各20只。采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型。NBP+Sham組和NBP+VD組大鼠術后1 d開始給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg/（kg·d），Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射（0.2 mL/d），各組大鼠均連續(xù)腹腔注射給藥7 d，每組按時間分為術后1周、2周、4周和8周4個亞組，于不同時間點斷頭取腦分離海馬組織。采用ELISA方法檢測海馬組織TNF-α和IL-1β的表達。結果 術后1、2、4、8周，VD組大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β的表達均明顯高于Sham組（P < 0.05）；術后8周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的表達明顯低于VD組大鼠（P < 0.05）；VD組大鼠海馬組織IL-1β的表達于2周時達到高峰期（P < 0.05）。 結論 VD大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達增加，NBP可通過降低VD大鼠海馬組織TNF-α的水平從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

[關鍵詞] 丁苯酞；血管性癡呆；海馬；腫瘤壞死因子α；白介素1β

[中圖分類號] R743 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）01（c）-0012-04

[Abstract] Objective To study the effects of 3-n-butylphthalide （NBP） on the expression of TNF-α and IL-1β at different time points in the hippocampus of vascular dementia rats. Methods A total of 80 Wistar rats were assigned to vascular dementia models （VD） group， vascular dementia models + NBP injection （NBP+VD） group， sham surgery + NBP injection （NBP+Sham） group and sham surgery （sham） group by randomized blocks， with 20 rats in each group. Vascular dementia rat model was established by ligating bilateral common carotid artery. The NBP+VD group and NBP+Sham group were intraperitoneally injected with NBP 5 mg/（kg·d）， VD group and Sham group were intraperitoneally injected with 0.2 mL/d saline for 7 days. Each group was divided into four subgroups （n=5） at 1， 2， 4 and 8 weeks after surgery. The rats in each group were decapitated to obtain brains at different time points， and hippocampus were isolated. TNF-α and IL-1β expressions in the hippocampus were determined by ELISA method. Results The expressions of TNF-α and IL-1β in the hippocampus of VD group were significantly higher than those of Sham group at each time point（P < 0.05）； the expression of TNF-α in the hippocampus of NBP+VD group was significantly lower than that of VD group at 8 weeks after surgery（P < 0.05）； the expression of IL-1β in the hippocampus of VD group reached peak level at 2 weeks after surgery. Conclusion The expression of TNF-α and IL-1β increase in the hippocampus of rats with vascular dementia. NBP may exert the protective effect by reducing TNF-α level in the hippocampus of vascular dementia rats.

[Key words] 3-n-butylphthalide； Vascular dementia； Hippocampus； Tumor necrosis factor-α； Interleukin-1β

丁苯酞（3-n-butylphthalide，NBP）是人工合成的消旋正丁基苯酞，作為臨床用于治療缺血性腦卒中的國家級一類新藥，NBP能夠明顯減輕急性缺血性腦卒中患者中樞神經(jīng)功能缺損[1]。隨著對NBP研究的不斷深入，目前發(fā)現(xiàn)NBP對血管性癡呆（vascular dementia，VD）也有較為明顯的改善作用[2-3]，但其作用機制還缺乏深入的研究。臨床研究觀察到VD患者血漿中促炎細胞因子水平明顯升高，并且促炎細胞因子水平與癡呆程度呈正相關[4]。Cunningham等[5]發(fā)現(xiàn)，腦組織中促炎細胞因子表達增加會加速癡呆的進展。TNF-α和IL-1β是兩種重要的促炎細胞因子，腦缺血后海馬中TNF-α和IL-1β表達增加與VD發(fā)生密切相關[6]。本研究在制備VD大鼠模型的基礎上，應用NBP給予干預治療，觀察不同時間點VD模型大鼠海馬組織TNF-α和IL-1β表達變化，進而探討NBP對VD的保護作用，為臨床應用NBP治療VD提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器

80只健康SPF級Wistar大鼠（雌雄各半），體重200～220 g，購于吉林大學基礎醫(yī)學院動物中心，動物合格證號：SCXK（吉）2003-001。丁苯酞氯化鈉注射液（石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，批準文號：國藥準字H20100041）。大鼠TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒和大鼠IL-1β酶聯(lián)免疫檢測試劑盒購自北京綠源博德生物科技有限公司。酶標儀（ELX800，美國Bio-Tek公司）。

1.2 實驗動物分組

大鼠飼養(yǎng)于吉林大學第二醫(yī)院動物實驗室，室內(nèi)溫度22～26℃，相對濕度40%～60%，光暗周期12 h，自由攝取食物和水，動物模型制備前適應性喂養(yǎng)7 d。按隨機區(qū)組法分為血管性癡呆模型（VD）組、血管性癡呆模型+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+VD）組、假手術+丁苯酞氯化鈉注射液（NBP+Sham）組和假手術（Sham）組4個組，每組20只；再將各組按時間分為術后1周、2周、4周和8周4個亞組，每個亞組5只。

1.3 動物模型制備

采用永久性雙側頸總動脈結扎法制備VD大鼠模型，具體操作如下：

VD組和NBP+VD組大鼠術前禁食、禁水8 h，10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作臺，常規(guī)消毒頸部手術區(qū)域，頸前正中作一長約1 cm的縱形切口，鈍性逐層分離皮下軟組織、頸前肌群，分離出氣管側后方的頸動脈鞘，進而分離頸總動脈與迷走神經(jīng)，以1號絲線永久結扎頸總動脈，同法結扎另一側頸總動脈。局部消毒后恢復組織層次并縫合皮膚。Sham組和NBP+Sham組大鼠除不結扎雙側頸總動脈外，其余操作與VD組和NBP+VD組大鼠一致。術后動物另放于干凈鼠籠飼養(yǎng)，自由獲取水源及飼料。

1.4 藥物干預

NBP+Sham組和NBP+VD組大鼠清醒后（術后1 d，可在籠中自由活動），給予丁苯酞氯化鈉注射液腹腔注射，劑量為5 mg/（kg·d）（藥物劑量根據(jù)成人常規(guī)每日劑量進行換算），Sham組和VD組大鼠給予生理鹽水腹腔注射（0.2 mL/d）。各組大鼠連續(xù)腹腔注射給藥7 d。

1.5 標本采集及檢測指標

各組大鼠在術后各時間點（1、2、4、8周），給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉（麻醉劑量：0.3 mL/100 g），生理鹽水心臟灌注5 min，斷頭取腦，分離雙側海馬，-70℃保存?zhèn)溆?。用ELISA法檢測各組大鼠海馬組織中TNF-α和IL-1β水平，按試劑盒說明書進行實驗操作，根據(jù)標準品的濃度及對應的吸光度（A）值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析和Tukey檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠海馬組織TNF-α的表達比較

不同時間點，各組大鼠海馬組織TNF-α的表達比較：①術后1、2、4、8周，VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯高于Sham組（P < 0.05）；②術后1、2周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯高于Sham組（P < 0.05）；③術后8周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯低于VD組大鼠（P < 0.05）。

不同組別大鼠各時間點海馬組織TNF-α的表達比較：術后1、2、4、8周，四組大鼠海馬組織TNF-α的含量結果比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P ﹥ 0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠海馬組織IL-1β的表達比較

不同時間點，各組大鼠海馬組織IL-1β的表達比較：術后1、2、4、8周，VD組和NBP+VD組大鼠海馬組織IL-1β的含量明顯高于Sham組（P < 0.05）。

不同組別大鼠各時間點海馬組織IL-1β的表達比較：①VD組大鼠2周時海馬組織IL-1β的含量明顯高于術后1、4、8周（P < 0.05）；術后1、4、8周時海馬組織IL-1β的含量無顯著性差異（P﹥0.05）。②NBP+VD組大鼠術后4、8周時海馬組織IL-1β的含量明顯低于術后1、2周（P < 0.05）。見表2。

3 討論

炎性損傷是VD的一個重要病理機制，腦缺血損傷引起多種炎性因子上調(diào)，如細胞間粘附分子1、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、一氧化氮（NO）、TNF-α、IL-1β等[7-8]，這些炎性因子可以激活小膠質細胞和星形膠質細胞，激活的膠質細胞又進一步釋放多種細胞因子和有毒介質，造成神經(jīng)元的損傷，并且可以破壞血腦屏障，血腦屏障的破壞又會增強炎性反應，造成繼發(fā)性的腦損害[9-11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)：VD病人血清IL-6明顯高于正常人群[12]；多梗死性癡呆患者腦脊液中TNF-α含量明顯高于對照組，因此認為多梗死性癡呆患者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性應答機制被激活，并且與病情的嚴重程度呈正相關[13]。動物實驗發(fā)現(xiàn)：VD大鼠腦脊液和血清中IL-6含量明顯升高，且IL-6含量越高，模型大鼠記憶學習能力越差[14]。腦組織缺血及缺血再灌注時，神經(jīng)元、內(nèi)皮細胞等被激活，釋放兩種重要的炎性因子TNF-α和IL-1β，進而刺激其他細胞因子的釋放，形成級聯(lián)反應，激活粒細胞、單核-吞噬細胞等，造成炎性反應損傷神經(jīng)元[15]；誘導血管活性物質的異常釋放，導致血管收縮、腦血流量進一步降低，加重腦缺血損傷[16]。炎性因子不僅影響神經(jīng)元的存活，還可以調(diào)節(jié)突觸可塑性，參與VD發(fā)病[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血后海馬中TNF-α和IL-1β表達增加與VD發(fā)生密切相關[6，17]。

TNF-α能夠影響星形膠質細胞、巨噬細胞和小膠質細胞的功能，導致細胞增殖、細胞外基質重塑[19]；激活核轉錄因子（NF-κB）進而引起星形膠質細胞釋放促炎細胞因子[20]；促使小膠質細胞和星形膠質細胞釋放興奮性神經(jīng)遞質（如谷氨酸），并且抑制星形膠質細胞再攝取谷氨酸，導致胞外谷氨酸水平持續(xù)增高，增加神經(jīng)毒性作用，引起細胞因子、毒性介質的積累，誘導神經(jīng)元死亡[21]。TNF-α還可以上調(diào)神經(jīng)元的谷氨酸受體，并促進神經(jīng)元和膠質細胞表達不規(guī)則趨化因子（Fractalkine），F(xiàn)ractalkine與其受體結合誘導黏附、趨化和激活其他炎性細胞，造成神經(jīng)元損傷[22]。本實驗發(fā)現(xiàn)：VD組大鼠1、2、4、8周時海馬組織TNF-α的含量均明顯高于Sham組，證實海馬組織TNF-α異常增加參與了血管性癡呆的病理過程。術后8周，NBP+VD組大鼠海馬組織TNF-α的含量明顯低于VD組大鼠（P < 0.05），提示NBP可以抑制腦缺血恢復期海馬組織TNF-α的過度表達，從而減弱因TNF-α引起的神經(jīng)損害，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

盡管IL-1β可能并不直接毒害神經(jīng)細胞，但IL-1β可以激活星形膠質細胞，通過NF-κB途徑促使膠質細胞釋放TNF-α和iNOs（iNOS可產(chǎn)生NO），NO對神經(jīng)細胞具有直接毒性，并且可以增加血腦屏障的通透性[23-24]。IL-1β還可以誘導星形膠質細胞表達ICAM-1、MCP-1等，促進單核細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤，加重神經(jīng)炎性反應，造成神經(jīng)損傷[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，VD組大鼠術后1、2、4、8周時海馬組織IL-1β含量均明顯高于Sham組，證實海馬組織IL-1β參與了血管性癡呆的病理過程。VD組大鼠2周時海馬組織IL-1β的含量明顯高于1、4、8周；提示IL-1β過表達在腦缺血2周時達到高峰。術后個時間點，NBP+VD組大鼠海馬組織IL-1β的含量與VD組大鼠相比均未發(fā)現(xiàn)明顯差異，提示NBP可能并不能影響VD大鼠海馬組織IL-1β的過度表達。

綜上所述，TNF-α和IL-1β表達增加參與了VD病理過程，其中IL-1β過表達在腦缺血2周時達到高峰。NBP可以抑制腦缺血恢復期海馬組織TNF-α的過度表達，減弱TNF-α引起的神經(jīng)損害，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，而NBP可能不影響VD大鼠海馬組織IL-1β的過度表達。

[參考文獻]

[1] 朱以誠，崔麗英，高山，等.丁苯酞注射劑治療急性腦梗死的多中心、隨機、雙盲雙模擬、對照III期臨床試驗[J].中華神經(jīng)科雜志，2014，47（2）：113-118.

[2] 程文姚，楊健，余新沛.丁苯酞軟膠囊與尼莫地平對卒中后血管性癡呆患者的療效[J].解放軍預防醫(yī)學雜志，2016，34（4）：516-518.

[3] 趙萬紅，羅超，龔應霞，等.消旋丁苯酞對慢性腦缺血大鼠認知功能的影響及其生化機制研究[J].中華老年醫(yī)學雜志，2014，33（4）：412-415.

[4] Zuliani G，Ranzini M，Guerra G，et al. Plasma cytokines profile in older subjects with late onset Alzheimer's disease or vascular dementia [J]. J Psychiatr Res，2007，41（8）：686-693.

[5] Cunningham C，Campion S，Lunnon K，et al. Systemic inflammation induces acute behavioral and cognitive changes and accelerates neurodegenerative disease [J]. Biol Psychiatry，2009，65（4）：304-312.

[6] Zhang XL，Zheng SL，Dong FR，et al. Nimodipine improves regional cerebral blood flow and suppresses inflammatory factors in the hippocampus of rats with vascular dementia [J]. J Int Med Res，2012，40（3）：1036-1045.

[7] Calabrese V，Giordano J，Signorile A，et al. Major pathogenic mechanisms in vascular dementia：roles of cellular stress response and hormesis in neuroprotection [J] J Neurosci Res，2016，94（12）：1588-1603.

[8] Mulugeta E，Molinaholgado F，Elliott MS，et al. Inflammatory mediators in the frontal lobe of patients with mixed and vascular dementia [J]. Dement Geriatr Cogn Disord，2008，25（3）：278-286.

[9] Wang J，Zhang HY，Tang XC. Cholinergic deficiency involved in vascular dementia：possible mechanism and strategy of treatment [J]. Acta Pharmacol Sin，2009，30（7）：879-888.

[10] Angelopoulos P，Agouridaki H，Vaiopoulos H，et al. Cytokines in Alzheimer's disease and vascular dementia [J]. Int J Neurosci，2008，118（12）：1659-1672.

[11] Schmitz M，Hermann P，Oikonomou P，et al. Cytokine profiles and the role of cellular prion protein in patients with vascular dementia and vascular encephalopathy [J]. Neurobiol Aging，2015，36（9）：2597-2606.

[12] Licastro F，Morini MC，Polazzi E，et al. Increased serum alpha 1-antichymotrypsin in patients with probable Alzheimer's disease：an acute phase reactant without the peripheral acute phase response [J]. J Neuroimmunol，1995，57（1-2）：71-75.

[13] 李強，王景周，張莉莉，等.腦梗死與多梗死性癡呆腦脊液中腫瘤壞死因子-α含量的測定[J].中國臨床神經(jīng)科學，2002，10（3）：239-241.

[14] 季永俠，袁榮峰.VD大鼠血清及腦脊液中IL-6水平變化[J].中國實用醫(yī)藥雜志，2007，2（9）：28-29.

[15] Spielmann S，Kerner T，Athlers O，et al. Early detection of increased tumour necrosis factor alpha（TNF alpha）and soluble TNF receptor protein plasma levels after trauma reveals association with the clinical course [J]. Acta Anaesthesiol Scand，2001，45（3）：364-370.

[16] 張昆南，曹金娟，劉世民，等.大鼠腦梗死后腦組織TNF-a、GFAP、NSE、BDNF、Nestin的表達和神經(jīng)功能變化[J].中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志，2013，20（5）：305-310.

[17] Li Y，Zhang Z，Zhao J，et al. Influences of Bushen Xingnao Decoction on expression of vascular endothelial growth factor，IL-1β and tumor necrosis factor-α in vascular dementia rats [J]. Pak J Pharm Sci，2015，28（6 Suppl）：2317-2320.

[18] Uslu S，Akarkarasu ZE，Ozbabalik D，et al. Levels of amyloid beta-42，interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha in Alzheimer's disease and vascular dementia [J]. Neurochem Res，2012，37（7）：1554-1559.

[19] Saha RN，Pahan K. Tumor necrosis factor-alpha at the crossroads of neuronal life and death during HIV-associated dementia [J]. J Neurochem，2003，86（5）：1057-1071.

[20] Han Y，He T，Huang DR，et al. TNF-alpha mediates SDF-1 alpha-induced NF-kappa B activation and cytotoxic effects in primary astrocytes [J]. J Clin Invest，2001，108（3）：425-435.

[21] Olmos G，Lladó J. Tumor necrosis factor alpha：a link between neuroinflammation and excitotoxicity [J]. Mediators Inflamm，2014，2014（9）：861231.

[22] Erichsen D，Lopez AL，Peng H，et al. Neuronal injury regulates fractalkine：relevance for HIV-1 associated dementia [J].J Neuroimmunol，2003，138（1-2）：144-155.

[23] Sudduth TL，Powell DK，Smith CD，et al. Induction of hyperhomocysteinemia models vascular dementia by induction of cerebral microhemorrhages and neuroinflammation [J]. J Cereb Blood Flow Metab，2013，33（5）：708-715.

[24] Vaccari JPDR，Dietrich WD，Keane RW. Activation and regulation of cellular inflammasomes：gaps in our knowledge for central nervous system injury [J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow & Metabolism，2014，34（3）：369-375.

[25] Brabers NA， Nottet HS. Role of the pro-inflammatory cytokines TNF-alpha and IL-1 beta in HIV-associated dementia [J]. Eur J Clin Invest，2006，36（7）：447-458.

（收稿日期：2016-10-17 本文編輯：李岳澤）