阿力木江·阿西木，吐爾洪江·阿布都熱西提，艾爾肯·阿木冬?

（新疆醫(yī)科大學，新疆 烏魯木齊 830054）

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院2014年6月～2014年12月收治的黃韌帶肥厚引起腰椎管狹窄患者為和單純腰椎間盤突出沒有黃韌帶肥厚患者的黃韌帶。退變組為黃韌帶肥厚的患者15個，年齡34～76歲。對照組為單純椎間盤突出，但沒有黃韌帶肥厚的年輕人5個，年齡在16～20歲。

1.2 方法

（1）用Image-proplus 6.0軟件做圖片分析對比累積光密度（IOD，integrated optical density）總數(shù)。

（2）常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察。

（3）免疫組織化學染色法：連續(xù)4微米切片，常規(guī)脫蠟至水→新鮮配置3%H2O2室溫孵育l0 min→PBS（磷酸緩沖鹽溶液）洗3次，每次3分鐘后進行修復抗原（抗原修復均采用微波加熱修復），將切片充分浸泡放入0.0lM的檸檬酸緩沖液中煮沸10分鐘，取出后室溫自然冷卻，用PBS沖洗3次，加入一抗（TGF-β抗體），置于濕盒4℃冷箱中過夜后取出，在室溫下平衡5分鐘后，用PBS洗3次，每次3分鐘，隨后分別滴入生物素化的二抗（抗兔IgG和抗小鼠IgG），放置在37℃恒溫箱中30分鐘后取出，再次用PBS洗3次，每次3分鐘，用DAB顯色5至10分鐘后通過光學顯微鏡觀察，適當時機終止顯色，用自來水沖洗，切片經過蘇木素復染后依次通過75%、80%、95%、10%酒精脫水，用二甲苯透明3次，每次5分鐘，最后用中性樹膠封片。每例均設陰性對照—空白對照（PBS代替一抗）。

免疫組化結果判定：選擇應用光學顯微鏡，并于免疫組織化學染色成功之后，對切片進行仔細的觀察。在每個切片當中選擇具有代表性的區(qū)域（共5個），于高倍顯微鏡視野之下對所選擇的區(qū)域進行觀察。各高倍鏡視野計數(shù)100個細胞，并計算出陽性細胞數(shù)在總細胞數(shù)中所占的比例。取5個視野的算術平均值。利用雙盲法對結果進行判定，并由2名專業(yè)的病理學家重復閱片，同時對免疫組化染色結果進行仔細的核定。視顯色細胞的比例進行計分，若顯色細胞不足10%，計0分；若顯色細胞在10～20%，計1分；若顯色細胞在21～50%，計2分；若顯色細胞超過50%，計3分。從細胞染色的強度上進行計分，具體為：若細胞無顯色，計0分；若細胞呈淺黃色，計1分；若細胞呈棕黃色，計2分；若細胞呈黃褐色，計3分。每例積分=顯色細胞比例計分*細胞染色強度計分。最高9分，最低0分。若總分＜3分，提示陰性“—”；若總分在3-5分之間，提示陽性“+”；若總分≥6分，提示強陽性“++”。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

大體病理學觀察肥厚的黃韌帶厚度均為5 mm，無光澤，脆性增加，部分發(fā)現(xiàn)鈣化及骨化，與周圍組織粘連明顯，不易分離，切下后呈團狀。正常腰椎黃韌帶厚度小于4 mm，表面光澤、透亮、柔軟，未發(fā)現(xiàn)鈣化及骨化，和周圍組織粘連不明顯，易于分離，切下后回縮快，呈卷曲狀。

用Image-proplus 6.0軟件做圖片分析對比累積光密度總數(shù)見對照組為2.4312422，退變組為2.6556708，兩者有顯著的差別。

黃韌帶肥厚患者HE染色有纖維軟骨變形，纖維排列紊亂，骨化及炎性細胞浸潤表現(xiàn)，而沒有黃韌帶肥厚患者的黃韌帶雖然有局部炎性改變外，沒有鈣化及骨化表現(xiàn)，纖維結構排列較整齊，二者差異顯著。

黃韌帶肥厚患者免疫組化表現(xiàn)為TGF-β表達陽性，染色呈黃色，細胞核消失，無正常結構，而黃韌帶沒有肥厚的TGF-β表達陰性，染色灰色，細胞核清楚可見，二者差異顯著。

表1 兩組成纖維細胞數(shù)的比較（±s）

表1 兩組成纖維細胞數(shù)的比較（±s）

注：經卡方檢驗，x2=5.894，P=0.016

±s對照組 5 10.16±6.32退變組 15 61.36±15.29分組 nx

表2 兩組TGF-β表達情況的比較（n，%）

3 討 論

腰椎管狹窄癥是40歲以上的中老年腰痛患者常見的腰椎疾病，黃韌帶肥厚是其主要病因之一。腰椎管內黃韌帶的肥厚可以引起腰痛及坐骨神經痛最初由Elsberg于1913年報道，Kaneyama等人[1]的研究表明，胸椎黃韌帶肥厚與骨化、反復機械張力導致的損傷修復有關。但是，相同年齡和相同的力學環(huán)境并沒有使所有人出現(xiàn)黃韌帶的肥厚。

最近幾年來，研究者們對細胞因子的作用越來越感興趣，并對其研究也越來越受到重視。黃韌帶肥厚的研究中與力學因素作用一樣重視生物化學因素作用。賈連順[3]等認為目前黃韌帶骨化相關研究已較為普遍，但大部分以研究胸椎黃韌帶為主，而腰椎黃韌帶的生物特性和退變機制方面的研究很少。我們針對腰椎黃韌帶做了文獻分析并對黃韌帶肥厚骨化做了初步研究得出結論黃韌帶肥厚退變與細胞因子密切相關。艾爾肯·阿木冬[4]等在手術中也發(fā)現(xiàn)腰椎黃韌帶肥厚明顯。Park et al[5]等研究者對腰椎管狹窄患者在術中取出的腰椎黃韌帶進行測量，發(fā)現(xiàn)其平均厚度為4.44 mm，比對照組患者的腰椎黃韌帶（2.44 mm）明顯厚。我們的標本基本符合上述厚度。Sairyo et al[6]等對77例10歲～85歲腰椎疾病患者的黃韌帶進行統(tǒng)計學分析，總計308個節(jié)段，發(fā)現(xiàn)腰2至骶1節(jié)段的黃韌帶厚度會隨著患者年齡的增大而逐漸增加，其中腰3～5節(jié)段的黃韌帶肥厚最為明顯，且其進展也最快，我們的研究也符合上述研究。

我們通過HE染色發(fā)現(xiàn)黃韌帶肥厚患者HE染色有纖維軟骨變形，纖維排列紊亂，骨化及炎性細胞浸潤表現(xiàn)，而沒有黃韌帶肥厚患者的黃韌帶雖然有局部炎性改變外，沒有鈣化及骨化表現(xiàn)，纖維結構排列較整齊，二者差異顯著。

當前針對TGF-β，也就是轉化生長因子-β的研究最多。相關研究表明，TGF-β能加快成纖維細胞以及成骨細胞外基質合成的速度，并能起到有效抑制新合成基質講解以及促進血管形成的作用。此外，也有報道稱，TGF-β能顯著提升膠原纖維的分泌量。Park等人[5]的研究表明，選擇術中取出的的黃韌帶，并對肥厚黃韌帶以及非肥厚黃韌帶進行TGF-β1濃度的檢測，結果顯示，前者的TGF-β1濃度明顯比后者高。Nakatani等人[8]通過牽拉術中取出的腰椎黃韌帶，并對其膠原纖維mRNA和TGF-β1水平進行檢測，結果表明，牽拉之后的TGF-β1水平明顯升高，并且，Ⅰ、Ⅲ以及Ⅴ型膠原纖維基因的表達能力也有所提高，但在加入TGF-β1抗體之后，膠原纖維mRNA水平則顯著降低，在加入外源性TGF-β1之后，膠原纖維mRNA水平表現(xiàn)出劑量依賴性增加的現(xiàn)象，提示，牽拉黃韌帶能夠提高TGF-β1水平。可盡管如此，Sairyo等人[6]的研究卻表明，當黃韌帶肥厚增加之時，TGF-β水平將顯著降低，而其它的一些研究也表明，瘢痕形成初期時，TGF-β會有表達，但在肥厚瘢痕愈合之后，TGF-β將會終止表達。所以，我們可以推測，黃韌帶肥厚初期中，TGF-β發(fā)揮著較大的作用，能顯著提高膠原纖維合成量。我們的初步研究也發(fā)現(xiàn)TGF-β在肥厚退變黃韌帶中表達明顯，但在黃韌帶肥厚形成的后期中，其它促進膠原纖維合成的細胞因子亦或者是生長因子也有參與。

目前通過圖片分析做面積（area）、平均光密度（density mean）、直徑（diameter）、累積光密度（IOD：integrated optical density）的測量，這些是有意義的測量統(tǒng)計數(shù)值，但IOD卻是總數(shù)（SUM）值更有意義。圖片分析對比累積光密度總數(shù)見對照組為2.4312422，退變組為2.6556708，兩者有明顯的差別。說明黃韌帶肥厚退變過程中有細胞凋亡起作用。

現(xiàn)階段，有諸多研究傾向于隨退變和椎間不穩(wěn)所致的黃韌帶反復損傷與纖維修復所引發(fā)的黃韌帶肥厚，可這一過程當中也有多種細胞因子參與介導不同階段的膠原纖維的合成。黃韌帶肥厚過程中是否存在多種細胞因子參與及其相互間作用，具有網絡性的特點，不能孤立討論某種因子的作用。部分患者同一節(jié)段單側黃韌帶肥厚，而對側并不肥厚的原因目前的生物力學、生物學機制都不能解釋。理論上講，對照標本應取健康的腰椎黃韌帶，但這不符合醫(yī)學倫理，因此在建立對照組的問題比較困難。目前腰椎黃韌帶肥厚研究所用的對照組基本上都取自腰椎間盤突出癥患者的黃韌帶，但此類病人的腰椎也屬于椎間不穩(wěn)，同樣存黃韌帶的牽拉，這些被牽拉的黃韌帶能分泌出相關的細胞因子亦或者是生長因子，可有效提高膠原纖維合成量，所以，對照組的標本量不能達到理想。如此一來，明確腰椎黃韌帶肥厚的機制仍然是一個難題，還需要我們深層次的研究。

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[3]賈連順.黃韌帶骨化與胸椎椎管狹窄癥[J].脊柱外科雜志,2007,5(3):185-187.

[4]艾爾肯·阿木冬,田慧中,呂 霞.用薄刃骨刀行半椎板切除全椎管減壓治療老年性腰椎管狹窄癥[J].中國矯形外科雜志,2011,19(16):1385-1387.

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[8]顧曉明,賈連順,陳雄生.合并腰椎疾患的下胸椎黃韌帶骨化臨床診治[J].臨床骨科雜志,2008,11(3):202-204.