劉存弟, 林大杰

?

基于新型納米團(tuán)簇?zé)晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移體系的構(gòu)建及其在葡萄糖檢測(cè)中的應(yīng)用

劉存弟, 林大杰

（溫州大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，浙江 溫州 325035）

通過合成生物兼容性優(yōu)異的新型納米團(tuán)簇，如碳、銅納米團(tuán)簇，并構(gòu)建了熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）體系，以此來對(duì)葡萄糖進(jìn)行高靈敏、高選擇性的檢測(cè)。通過熒光光譜分析儀、透射電子顯微鏡和紅外光譜等進(jìn)行表征。在最優(yōu)條件下，系統(tǒng)熒光強(qiáng)度隨葡萄糖濃度的增加呈線性增強(qiáng)，線性范圍是9 ~54 μM，檢測(cè)限是6.39 μM。該探針具有較高的靈敏度和選擇性。

關(guān)熒光；葡萄糖；碳量子點(diǎn)；銅納米簇

在自然界中眾多的生物化合物中，葡萄糖是我們?nèi)粘Ｉ钪斜容^重要的物質(zhì)之一。而且糖尿病也與葡萄糖有著密切的聯(lián)系。人體血糖濃度與正常值的比較是判斷高血糖癥狀的標(biāo)準(zhǔn)，正常的血糖濃度范圍有兩種情況，一種是空腹（3.9~6.2 mM），另一種是飯后2 h（3.9~7.8 mM）。糖尿病還可以引起一些其他疾病，比如腎衰竭、心臟病和失明[1, 2]。因此，葡萄糖的定量檢測(cè)在很多領(lǐng)域都具有非常重要的意義，包括從生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用到生態(tài)方面等諸多領(lǐng)域[3]。因此，不管是醫(yī)學(xué)上還是科研領(lǐng)域都迫切需要對(duì)葡萄糖的檢測(cè)方法進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)中所用的溶劑全部為超純水Milli-Q(≧18 MΩ)，是由超純水系統(tǒng)(Millipore, Biocel)制備的。用到的所有試劑有苯硼酸、苯硼酸、二水合氯化銅、硼氫化鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、3-巰基-1，2-丙二醇、葡萄糖蔗糖、D-(+)-半乳糖、D-果糖、麥芽糖、β-乳糖均購于上海阿拉丁試劑有限公司。

主要儀器有F-7000熒光光譜儀（日本日立公司），Avatar 360紅外分光光譜儀（美國尼高力儀器公司），JEM-2100F透射電子顯微鏡TEM（日本電子），SES 2002 X射線光電子能譜儀XPS(日本島津公司)。

1.2 納米材料的合成及功能化

1.2.1 硼酸功能化的碳量子點(diǎn)(C-dots)的合成

根據(jù)文獻(xiàn)用苯硼酸一步自身還原合成碳量子點(diǎn)的方法[4]，將0.2 g苯硼酸溶于20 mL去離子水中，室溫?cái)嚢?0 min，然后逐滴攪拌加入NaOH溶液使pH=9，當(dāng)溶液變得澄清后全部轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜內(nèi)膽中，放入烘箱中160 ℃自身還原8 h，然后冷卻至室溫，用超濾管在10 000 r/min下離心20 min除去未反應(yīng)的苯硼酸，再用去離子水清洗2~3次，在超濾管的底部得到了硼酸功能化的碳量子點(diǎn)(C-dots)，保存在-4 ℃的冰箱中待用。

1.2.2 3-巰基-1，2-丙二醇(MG)功能化的銅納米簇（CuNCs）的合成[5]

0.037 g無水氯化銅溶于20 mL去離子水中，加入過量的3-巰基-1，2-丙二醇做保護(hù)劑，室溫?cái)嚢? min，形成黃色凝膠溶液，然后逐滴攪拌加入NaOH溶液使溶液變澄清，約10 min后加入適量新配制的硼氫化鈉溶液作為還原劑還原銅鹽，然后將溶液全部轉(zhuǎn)移到反應(yīng)釜中內(nèi)膽中，放入烘箱中120℃反應(yīng)5 h，然后冷卻至室溫，用超濾管在10 000 r/min下離心20 min除去未反應(yīng)的保護(hù)劑和多余的氫氧化鈉，再用去離子水清洗2~3次，在超濾管的底部得到了3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇（CuNCs），保存在-4 ℃的冰箱中待用[6]。

2 性能與表征

2.1 硼酸功能化的碳點(diǎn)(C-dots)的表征

2.1.1 透射電子顯微鏡（TEM）

通過透射電子顯微鏡（TEM）來觀察C-dots的形貌特征和尺寸大小。如圖1所示，a圖是所合成的碳量子點(diǎn)的整體分散情況，分布很均勻，形貌為球形，直徑大小范圍從2.5 nm到4.5 nm，平均直徑大約是4 nm左右；b圖是碳量子點(diǎn)局部放大圖，可以看到納米材料的晶格常數(shù)是0.23 nm；c圖是碳量子點(diǎn)中加入銅納米簇后發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的透射電鏡圖，由于銅納米簇的加入拉近了碳量子點(diǎn)之間的距離，圖中看出材料之間發(fā)生了團(tuán)聚；d圖是在c圖的基礎(chǔ)上再加入葡萄糖破壞了熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，碳量子點(diǎn)之間的距離加大，團(tuán)聚現(xiàn)象也隨之減弱。

圖1 透射電鏡圖（TEM）

（a）碳量子點(diǎn)整體圖；（b）碳量子點(diǎn)局部圖；（c）向碳量子點(diǎn)中加入銅納米簇發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移；（d）向c中加入葡萄糖

2.2 實(shí)驗(yàn)機(jī)理

本實(shí)驗(yàn)基于納米材料之間可以建立熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）體系的原理，建立了一種銅納米簇（CuNCs）猝滅碳量子點(diǎn)(C-dots)的新型納米熒光探針實(shí)現(xiàn)對(duì)葡萄糖定量檢測(cè)的新方法。碳量子點(diǎn)(C-dots)具有良好的光學(xué)性質(zhì)及高的量子產(chǎn)率，因此可以作為FRET體系中一種理想的供體；同時(shí)，由于銅納米簇（CuNCs）具有高的消光系數(shù)，可以作為FRET中一種良好的熒光猝滅劑。根據(jù)硼酸鍵與鄰二醇可以可逆結(jié)合的原理，將3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇（CuNCs）靠近硼酸功能化的碳量子點(diǎn)（C-dots）并且達(dá)到了FRET發(fā)生的距離范圍之內(nèi)，從而產(chǎn)生了高效率的FRET。將一定量的碳量子點(diǎn)（C-dots）和不同濃度的銅納米簇（CuNCs）混合特異性結(jié)合發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，使碳量子點(diǎn)熒光猝滅，找到適合測(cè)定葡萄糖濃度的平臺(tái)，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，葡萄糖與巰基甘油競(jìng)爭(zhēng)同硼酸的結(jié)合位點(diǎn)，使得FRET的效率降低，在一定可控范圍里表現(xiàn)為熒光峰發(fā)射位置不變而吸收強(qiáng)度變化，隨葡萄糖濃度的增加碳量子點(diǎn)（C-dots）的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)。從而可通過對(duì)熒光峰的強(qiáng)度變化的分析定量測(cè)定葡萄糖的濃度，實(shí)現(xiàn)葡萄糖的高選擇性檢測(cè)。

2.3 傳感器性能測(cè)試

2.3.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)體系的構(gòu)建

根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)步驟在20 μL碳量子點(diǎn)中加100 μL PBS (pH=7.4，0.2M)和不同量的3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇(0、20、60、100、140、180、220、260、100 μL)，然后用去離子水均稀釋至1 mL，室溫孵化半小時(shí)，以碳量子點(diǎn)的熒光為熒光源來測(cè)熒光，如圖2所示，隨著銅納米簇加入的量的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)銅納米簇的量為260 μL和300 μL時(shí)熒光強(qiáng)度幾乎重合，不能再降低，故選擇銅納米簇300 μL作為測(cè)定葡萄糖的平臺(tái)。

圖2 不同體積的銅納米簇（CuNCs）對(duì)FRET體系熒光強(qiáng)度的影響

2.3.2 定量測(cè)定葡萄糖

根據(jù)之前選出的測(cè)定葡萄糖的平臺(tái)構(gòu)建葡萄糖熒光傳感器，由圖3所示，在所構(gòu)建的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系的基礎(chǔ)上分別加入不同濃度的葡萄糖(0、9、18、27、36、54 μM)，然后均用去離子水稀釋至1.3 mL，室溫孵化60 min后測(cè)熒光。

(a)圖中顯示，隨著葡萄糖濃度的增加熒光強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)，但是幅度不是很大，因?yàn)槠咸烟桥c苯硼酸的結(jié)合能力大于3-巰基-1，2-丙二醇功能化的銅納米簇，故通過競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)使C-dots與CuNCs的距離變大，不滿足FRET的發(fā)生所需要的條件，C-dots熒光恢復(fù)，但還有部分CuNCs與C-dots結(jié)合，所以熒光不能全部恢復(fù)。

(b)圖是在完全相同的條件下進(jìn)行了三次實(shí)驗(yàn)所得到的測(cè)定葡萄糖的校準(zhǔn)圖，圖中展現(xiàn)了熒光強(qiáng)度與葡萄糖濃度在范圍9~54 μM內(nèi)有很好的線性關(guān)系，線性回歸方程是=2.11×Cglucose(μM)+232.02，相關(guān)系數(shù)是2=0.988。根據(jù)LOD=3/的比值（是被測(cè)分析物濃度最小時(shí)的背景信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差，是目標(biāo)分析物濃度與熒光強(qiáng)度間線性關(guān)系式的斜率），可以推算出本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的傳感器的檢測(cè)限為6.39 μM。

圖3 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的方法在熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系中監(jiān)測(cè)葡萄糖(0、9 、18 、27、36、54 μM)

2.4 傳感器選擇性測(cè)試

本文論述的生物傳感器加入其他干擾糖類，如果糖、蔗糖、半乳糖、麥芽糖和β-乳糖，監(jiān)測(cè)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度恢復(fù)程度。36 μM的各種糖類及葡萄糖分別加入相同條件下構(gòu)建的生物傳感器中。

圖4 生物傳感器的選擇性（葡萄糖和其他糖類的濃度均是36 μM）

如圖4所示，其他干擾糖類在相同濃度下對(duì)生物傳感器的熒光強(qiáng)度恢復(fù)甚微，只有葡萄糖和麥芽糖對(duì)生物傳感器熒光強(qiáng)度有一定的恢復(fù)，說明生物傳感器對(duì)葡萄糖有一定的選擇性，而麥芽糖在水溶液中會(huì)水解生成葡萄糖，故對(duì)本實(shí)驗(yàn)的傳感器也有一定的響應(yīng)。由此可得出的結(jié)論是本文論述的熒光生物傳感器對(duì)葡萄糖有較強(qiáng)的選擇性。

3 結(jié)果與討論

本章實(shí)驗(yàn)制備的熒光葡萄糖傳感器結(jié)合了納米材料之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)和硼酸酯鍵與鄰二醇的特異性可逆結(jié)合以及葡萄糖的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。該方法展示了比較寬的檢測(cè)范圍和比較好的檢出限。此外，本文論述的傳感器根據(jù)其他的二塘類或者多糖類的水解產(chǎn)生葡萄糖相互作用，可用于定量檢測(cè)其他二塘類或者多糖類生物分子。

[1] Li Y, Zhong Y, Zhang Y, et al. Carbon quantum dots/octahedral Cu 2 O nanocomposites for non-enzymatic glucose and hydrogen peroxide amperometric sensor[J]. Sensors & Actuators B Chemical, 2015, 206(3): 735-743.

[2] 吳忠玉, 方浩, 徐文方. 基于有機(jī)硼酸的葡萄糖熒光傳感器的研究進(jìn)展[J]. 有機(jī)化學(xué), 2007, 27(7): 830-836.

[3] Chen Z, Li Q, Wang X, et al. Potent method for the simultaneous determination of glutathione and hydrogen peroxide in mitochondrial compartments of apoptotic cells with microchip electrophoresis-laser induced fluorescence[J]. Analytical Chemistry, 2010, 82(5): 2006-2012.

[4] Shen P, Xia Y. Synthesis-modification integration: one-step fabrication of boronic acid functionalized carbon dots for fluorescent blood sugar sensing[J]. Anal Chem, 2014, 86(11): 5323-5329.

[5] 余明明, 劉東志, 李巍, 等. 巰基丙酸保護(hù)的納米銀制備及熱分解行為研究[J]. 化學(xué)工業(yè)與工程, 2015, 32(6).

[6] Tang Y, Yang Q, Wu T, et al. Fluorescence enhancement of cadmium selenide quantum dots assembled on silver nanoparticles and its application to glucose detection[J]. Langmuir, 2014, 30(22): 6324-6330.

Construction of Fluorescence Resonance Energy Transfer System Based on Novel Nanoclusters and Its Application in Glucose Detection

,

（Wenzhou University, Zhejiang Wenzhou 325035，China）

A new type of nano clusters with excellent biocompatibility was synthesized, such as carbon, copper nanoclusters;and the fluorescence resonance energy transfer (FRET) system was constructed in order to detect glucose. The system was characterized by fluorescence spectroscopy, transmission electron microscopy and infrared spectroscopy. The results show that, under optimized experimental conditions, the fluorescence intensity increases linearly with the increase of glucose concentration in the range of 9 ~54 μM, and the detection limit is 9 μM. The probe has high sensitivity and selectivity.

fluorescence; glucose; C-dots; CuNCs

2016-03-20

劉存弟（1989-），女，碩士，山西省忻州市人，2017年畢業(yè)于溫州大學(xué)化學(xué)專業(yè)，研究方向：分析化學(xué)。

林大杰（1978-），男，副教授，博士，研究方向：分析化學(xué)。

TQ 028

A

1004-0935（2017）05-0423-03