陸健康++艾明艷++李述剛

摘要：在獲得高特異性抗CPPU單克隆抗體的基礎(chǔ)上，采用活性酯法將CPPU-H1與BSA、CPPU-H2與OVA偶聯(lián)制備得到免疫抗原CPPU-H1-BSA和包被抗原CPPU-H2-OVA；用CPPU-H1-BSA對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，通過(guò)雜交瘤技術(shù)篩選獲得了1株抗CPPU單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株B7B6 24。經(jīng)過(guò)體內(nèi)誘生腹水法制備抗體，測(cè)定抗體亞類(lèi)為IgG1，效價(jià)為1∶32 000。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)條件的優(yōu)化，建立了一種檢測(cè)CPPU的方法，該方法IC50值為3.89 ng/mL；該抗體與四螨嗪、赤霉素、噻苯隆幾乎不存在交叉反應(yīng)；利用所建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)葡萄樣品進(jìn)行檢測(cè)，平均加標(biāo)回收率為91.4%～112.4%，變異系數(shù)為5.9%～14.4%。本研究所建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法具有低成本、高準(zhǔn)確性和高靈敏度的特點(diǎn)，可以用來(lái)對(duì)葡萄中的CPPU殘留情況進(jìn)行檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：氯吡脲；單克隆抗體；間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.8 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）21-5584-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.037

Preparation of Anti-CPPU Monoclonal Antibody and Development of

an Indirect Competitive ELISA Method

LU Jian-kang，Ai Ming-yan，LI Shu-gang

（Xinjiang Production & Construction Group Key Laboratory of aricultural Products Processing in Xinjiang South，

Tarim University，Alaer 843300，Xinjiang，China）

Abstract： A method to rapidly detect forchlorfenuron（CPPU） was developed by Indirect competitive ELISA on the basis of obtaining the Anti-CPPU Monoclonal Antibody with high specificity. CPPU-H1-BSA（immunogenic antigen） and CPPU-H2-OVA（coating antigen） were prepared by coupling with CPPU-H1 and CPPU-H2 with carrier proteins using active ester method，respectively. Through a hybridoma cell line，a strain of cells B7B6 24 which can produce anti-CPPU on monoclonal antibody was obtained. Ascites was produced by mice vivo culcure，the monoclonal antibody characterized by IgG1 isotype，and the ELISA titer of ascites was 1∶32 000. A indirect competitive ELISA was developed for the detection of CPPU by optimizing experimental conditions. The IC50 value was 3.89 ng/mL，it did not react with clofentezine， gibberellic acid，thidiazuron. The average recovery rate for CPPU from grape samples were ranged from 91.4% to 112.4% and the variation coefficient were between 5.9%～14.4%. The indirect competitive ELISA allows for accurate，sensitive，and low-cost for determination of CPPU residues in grape.

Key words： CPPU； monoclonal antibody； indirect competitive ELISA

氯吡脲（forchlorfenuron）又名吡效隆、CPPU，化學(xué)名稱(chēng)為1-（2-氯-4-吡啶基）-3-苯基脲，是膨大劑的主要成分，具有促進(jìn)細(xì)胞增大、分化、分裂、防止落花以及提高座果率等多方面作用[1]。CPPU在西瓜[2]、葡萄[3]、獼猴桃[4，5]、菠蘿[6]等瓜果類(lèi)植物中的應(yīng)用研究較多。在CPPU的實(shí)際使用過(guò)程中，存在著片面追求大果形以及高產(chǎn)量而高劑量、高濃度噴灑的問(wèn)題，從而導(dǎo)致各類(lèi)瓜果貯藏期縮短以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)降低[7]。此外，殘留于瓜果以及其他食品中的CPPU還可能對(duì)人類(lèi)以及環(huán)境中的其他生物造成潛在的影響，如美國(guó)環(huán)境保護(hù)署指出人類(lèi)長(zhǎng)期接觸CPPU會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝紊亂以及體形消瘦等問(wèn)題[8]、高劑量CPPU可能誘導(dǎo)雌性大鼠青春期啟動(dòng)延遲[9]等。因此，中國(guó)、美國(guó)、日本以及歐盟等對(duì)CPPU的最大殘留量作出了嚴(yán)格的限定，中國(guó)規(guī)定西瓜和黃瓜中的最大殘留量為0.1 mg/kg，獼猴桃和葡萄中的最大殘留量為0.05 mg/kg。

目前，對(duì)于CPPU殘留的檢測(cè)方法較多，主要包括液相色譜法[10-13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14，15]、近紅外高光譜成像法[16]以及免疫分析方法[17，18]等。免疫學(xué)分析方法具有簡(jiǎn)便、快速、高通量、靈敏以及成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，適合于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本研究使用單克隆抗體技術(shù)，制備抗CPPU的高特異性和靈敏度的單克隆抗體，并在此基礎(chǔ)上建立了果品中快速檢測(cè)CPPU的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法，為后續(xù)開(kāi)發(fā)ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑 牛血清白蛋白（BSA）、卵白蛋白（OVA）、N-羥基硫代琥珀酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，購(gòu)自Sigma公司；單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，購(gòu)自Thermo公司；CPPU等農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 細(xì)胞株及試驗(yàn)動(dòng)物 鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0由深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司提供；清潔級(jí)Balb/c純種雌性小鼠及普通級(jí)雌性昆明鼠由廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 儀器與設(shè)備 WD-2102A型酶標(biāo)儀（北京市六一儀器廠(chǎng)）；FA/JA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TDL-5-A（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；LHS-150 SC型恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 人工抗原的合成與鑒定

按照文獻(xiàn)[17]的方法稍作修改后合成N-（4-羧基苯基）-N-3-氯吡啶基-2-甲酰二胺（CPPU-H1）和N-（4-乙酸苯基）-N-3-氯吡啶基-2-甲酰二胺人工半抗原（CPPU-H2），經(jīng)質(zhì)譜鑒定為目標(biāo)產(chǎn)物。然后采用活性酯法合成CPPU完全抗原，具體操作如下：稱(chēng)取0.1 mmol CPPU-H1（或CPPU-H2）溶解于0.5 mL二甲基甲酰胺中，加入0.2 mmol N-羥基琥珀的酰亞胺和0.2 mmol二環(huán)己基碳二亞胺，4 ℃條件下避光攪拌反應(yīng)過(guò)夜后4 000 r/min離心10 min，離心后的上清液為A液。稱(chēng)取6 mmol BSA（或6 mmol OVA）溶于適量0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）中，攪拌溶解為B液；4 ℃攪拌條件下，將A液逐滴加入到B液中，4 ℃攪拌反應(yīng)過(guò)夜；將反應(yīng)液轉(zhuǎn)入透析袋中，4 ℃攪拌條件下透析3 d，每天更換透析液3次；將透析液分裝后置于-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

合成的人工抗原CPPU-H1-BSA、CPPU-H1、BSA、CPPU-H2-OVA、CPPU-H2以及OVA在波長(zhǎng)200～360 nm范圍內(nèi)分別進(jìn)行紫外光譜掃描，通過(guò)比對(duì)掃描曲線(xiàn)判斷是否合成成功。

1.3 單克隆抗體的制備

1.3.1 動(dòng)物免疫 將制備好的免疫抗原CPPU-H2-OVA與等量弗氏完全佐劑乳化完全后對(duì)6～8周齡雌性Balb/c小鼠進(jìn)行皮下多點(diǎn)免疫，100 μg/只。二、三免時(shí)采用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，皮下多點(diǎn)以及腹腔免疫，100 μg/只，免疫間隔為2周。第4次免疫后的第7天從小鼠尾部取血測(cè)定抗體效價(jià)。細(xì)胞融合前3 d腹腔免疫CPPU-H2-OVA，50 μg/只以加強(qiáng)免疫。

1.3.2 細(xì)胞融合及篩選 取抗血清效價(jià)好以及靈敏度高的小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，然后先后采用含HAT和HT的培養(yǎng)液對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)篩選；待細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)1/2～1/3的小孔底部后，取雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行間接ELISA檢測(cè)。取呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性的亞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，如此反復(fù)2～4次，待所克隆孔中上清液中的抗體陽(yáng)性率為100%時(shí)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，建株后分裝、凍存。

1.3.3 腹水的制備及純化 Balb/c雌性小鼠提前1周腹腔注射0.5 mL降植烷；取凍存細(xì)胞株，復(fù)蘇后，大量培養(yǎng)繁殖，收集細(xì)胞，用不完全培養(yǎng)基洗滌2次后，再用10 mL不完全培養(yǎng)基懸浮，計(jì)數(shù)；每只小鼠腹腔注射1.5×107個(gè)單克隆細(xì)胞，待小鼠腹部明顯膨大時(shí)采集腹水，1 000 r/min離心10 min，去除上層脂肪和下層纖維蛋白及細(xì)胞，收集中層即為小鼠腹水，取部分腹水利用ELISA法測(cè)定其效價(jià)，其余分裝后于-70 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 抗體效價(jià)的測(cè)定 采用間接ELISA法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)，分別以不同濃度的CPPU-H1-BSA包被抗原包被酶標(biāo)板，將單克隆抗體從1∶2 000開(kāi)始倍比稀釋作為1抗，以HRP-羊抗鼠IgG作為二抗，進(jìn)行間接ELISA法測(cè)定，選擇OD450 nm為1.0左右的抗體最高稀釋倍數(shù)作為單克隆抗體的效價(jià)。

1.4.2 抗體的亞型鑒定 采用間接ELISA法對(duì)單克隆抗體的亞型進(jìn)行鑒定。

1.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的建立

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 根據(jù)間接ELISA棋盤(pán)方陣滴定法確定的最佳抗原包被濃度以及抗體稀釋倍數(shù)進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)，在此過(guò)程中確定最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間以及競(jìng)爭(zhēng)模式。根據(jù)最佳反應(yīng)條件，用甲醇將競(jìng)爭(zhēng)抗原濃度稀釋至0.1、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9 ng/mL進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)。以CPPU的濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、競(jìng)爭(zhēng)抑制率為縱坐標(biāo)建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算CPPU的IC50值。

1.5.2 單克隆抗體特異性分析 選擇四螨嗪、赤霉素、噻苯隆分別代替CPPU作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并分別計(jì)算IC50值，按公式計(jì)算交叉反應(yīng)率CR（%）：CR=（IC50 CPPU/IC50其他藥物）×100%。

1.6 加標(biāo)回收率測(cè)定

將市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)的葡萄經(jīng)充分破碎后，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.0 g葡萄漿樣品，分別加入一定量的CPPU標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其濃度分別為10、20、50 ng/g，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)；分別往每個(gè)樣品中加入15 mL乙腈和3 g氯化鈉，振蕩提取10 min后，4 500 r/min離心10 min，靜置20 min，取5 mL上清液氮?dú)獯蹈珊笥眉状紡?fù)溶后用于ELISA檢測(cè)，計(jì)算相應(yīng)的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 CPPU完全抗原的鑒定

在波長(zhǎng)為200～360 nm范圍內(nèi)，對(duì)半抗原、載體蛋白以及人工抗原的紫外吸收特性進(jìn)行分析，以鑒定完全抗原是否合成成功。由圖1可知，CPPU-H1-BSA在280 nm處有BSA的特征吸收峰，在316 nm以及260 nm處存在CPPU-H1的2個(gè)特征吸收峰，說(shuō)明CPPU-H1-BSA偶聯(lián)成功；OVA在279 nm處存在特征吸收峰，CPPU-H2在291 nm處存在特征吸收峰，而CPPU-H2-OVA的特征吸收峰在283 nm處，證明CPPU-H2-OVA偶聯(lián)成功。

2.2 抗血清效果分析

抗血清的效價(jià)與抗血清中特異性抗體濃度成正比，而活化的B淋巴細(xì)胞是抗體分泌細(xì)胞，因此，效價(jià)越高則活化的B淋巴細(xì)胞越多。在融合時(shí)選用效價(jià)高的小鼠脾細(xì)胞有利于融合出針對(duì)目標(biāo)抗原的雜交瘤細(xì)胞。采用棋盤(pán)方陣滴定法確定最佳的包被抗原濃度為2 μg/mL，其中3號(hào)小鼠抗血清效價(jià)最高。分別采用濃度為0、500 ng/mL的CPPU作為競(jìng)爭(zhēng)抗原，對(duì)不同小鼠的抗血清進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，記錄OD450 nm并計(jì)算抑制率，其結(jié)果如表1所示。從表1中可以看出在競(jìng)爭(zhēng)抗原CPPU濃度達(dá)到500 ng/mL時(shí)，3號(hào)小鼠抗血清的抑制率超過(guò)90%，因此，選用3號(hào)小鼠的脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。

2.3 單克隆抗體細(xì)胞篩選

經(jīng)過(guò)細(xì)胞融合、篩選，得到了1株穩(wěn)定分泌抗CPPU抗體的雜交瘤細(xì)胞B7B6 24。經(jīng)過(guò)多次傳代、凍存和復(fù)蘇，該株雜交瘤細(xì)胞能保持很好的抗體分泌能力且效價(jià)穩(wěn)定。

2.4 單克隆抗體亞型鑒定

經(jīng)降植烷處理后的小鼠腹腔注射B7B6 24雜交瘤細(xì)胞，10～15 d后采集腹水。以2 μg/mL包被抗原包被酶標(biāo)板，采用間接ELISA方法檢測(cè)腹水抗體的亞型，檢測(cè)結(jié)果顯示B7B6 24的抗體亞型為IgG1。采用間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體B7B6 24的腹水效價(jià)為1∶32 000。

2.5 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的建立

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 根據(jù)間接ELISA棋盤(pán)方陣滴定法確定的最佳抗原包被濃度以及抗體稀釋倍數(shù)進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA試驗(yàn)，在此過(guò)程中確定最佳競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間、封閉時(shí)間、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間以及競(jìng)爭(zhēng)模式。4 ℃包被12 h；抗原最佳包被濃度2 μg/mL，單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶32 000；5%脫脂奶粉封閉120 min；板內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式；37 ℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)90 min；酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶4 000；酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為60 min。

由圖2可知，線(xiàn)性回歸方程為y=-0.316 3Ln（x）+0.686 5（R2=0.990 1），其IC50值為3.89 ng/mL。

2.5.2 單克隆抗體特異性分析 通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)，表明B7B6 24雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的單克隆抗體與四螨嗪、赤霉素、噻苯隆的交叉反應(yīng)率均小于0.39%（表2），表明所制備的單克隆抗體對(duì)CPPU具有高度的特異性。

2.6 加標(biāo)回收率

在葡萄樣品中加入3種不同濃度的CPPU標(biāo)準(zhǔn)品溶液并進(jìn)行提取，采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法進(jìn)行測(cè)定樣品加標(biāo)回收率，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。有結(jié)果可知，樣品平均加標(biāo)回收率在91.4%～112.4%之間，變異系數(shù)在5.9%～14.4%之間（表3），表明該方法具有較好的準(zhǔn)確性和靈敏度。

3 小結(jié)與討論

以活性酯法制備的CPPU-H1-OVA為免疫抗原免疫小鼠，獲得的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選，得到了一株穩(wěn)定分泌抗CPPU抗體的雜交瘤細(xì)胞B7B6 24；將其注射入小鼠腹腔，獲得腹水，經(jīng)鑒定腹水抗體亞型為IgG1，效價(jià)為1∶32 000；使用該抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法，該方法中最佳包被條件為4 ℃包被12 h、抗原最佳包被濃度2 μg/mL、單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶32 000、5%脫脂奶粉封閉120 min、采用板內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)模式37 ℃競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)90 min、酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?∶4 000、酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間為60 min，IC50值可以達(dá)到3.89 ng/mL；抗體與其它幾種農(nóng)藥交叉反應(yīng)很??；平均加標(biāo)回收率為91.4%～112.4%，變異系數(shù)為5.9%～14.4%。因此可以運(yùn)用本研究所建立的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法對(duì)葡萄等果品中CPPU殘留量進(jìn)行初步檢測(cè)與篩選。

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