徐旺燁++樊琛++李一經(jīng)

摘要：采用流式細(xì)胞術(shù)法對(duì)大腸桿菌的血清抗性進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)涂板法相比較，探討流式細(xì)胞術(shù)在血清抗性檢測(cè)方法中的應(yīng)用。結(jié)果表明，兩者呈正相關(guān)關(guān)系（P=0.034<0.05），流式細(xì)胞術(shù)法可以代替涂板法對(duì)大腸桿菌的血清抗性進(jìn)行檢測(cè)。該方法可以減少由于涂板不均勻、人工計(jì)數(shù)等造成的誤差，且易操作、計(jì)算少、耗時(shí)少，數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

關(guān)鍵詞：血清抗性；涂板法；流式細(xì)胞術(shù)法

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）21-5571-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.033

Comparison and Analysis of Two Methods of Serum Resistance Tests

XU Wang-ye1，F(xiàn)AN Chen2，LI Yi-jing1

（1.College of Veterinary Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；

2.Agricultural College of Liaocheng University， Liaocheng 252059，Shandong，China）

Abstract： Flow cytometry and plating method were used to detect serum resistance of Escherichia coli. The results showed that there was a positive correlation between flow cytometry and conventional plating method（P=0.034<0.05）. The flow cytometry method can replace plating to test the serum resistance of E. coli. The method can reduce the error beause of uneven plating and counting by eyes. In comparison with plating method， this flow cytometry had less calculation and takes less time，but accurater data.

Key words： serum resistance； plating method； method of flow cytometry

大腸桿菌是自然環(huán)境中的常在菌，處于溫血?jiǎng)游锬c道下段[1]，一般不會(huì)致病，但當(dāng)飼養(yǎng)環(huán)境差，通風(fēng)不好，營(yíng)養(yǎng)缺乏或應(yīng)激等情況出現(xiàn)會(huì)誘發(fā)雞大腸桿菌病[2]。雞大腸桿菌病的主要病型有腹瀉、心包炎、眼炎、腹膜炎和輸卵管炎、臍炎等[3]。雞大腸桿菌病是集約化養(yǎng)殖廠經(jīng)常發(fā)生的一類疾病，多危害雛雞，死亡率為5%～50%[4]，造成經(jīng)濟(jì)損失。大腸桿菌致病過(guò)程為：大腸桿菌在呼吸道上皮或腸黏膜上皮黏附聚集定殖，進(jìn)一步a侵染機(jī)體并增殖，再進(jìn)入血液循環(huán)，形成全身性感染。當(dāng)大腸桿菌進(jìn)入血液后，將面對(duì)來(lái)自于血液如溶菌素、補(bǔ)體等物質(zhì)的殺菌作用，此時(shí)大腸桿菌對(duì)血清的抵御能力將關(guān)系到其能否進(jìn)一步擴(kuò)大對(duì)宿主機(jī)體的感染程度。Iss基因（Increased serum survival gene，Iss）的作用是增強(qiáng)大腸桿菌在血清中的存活能力，是大腸桿菌的重要毒力基因之一[5]。此外，外膜蛋白也具有抵抗血清殺菌作用的能力[6]。有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)吸光度的變化來(lái)衡量大腸桿菌的血清抗性[7]，此種方法相對(duì)粗糙。通常都使用涂板的方法對(duì)大腸桿菌的血清抗性進(jìn)行檢測(cè)[8，9]，本研究提供一種基于流式細(xì)胞術(shù)的方法來(lái)檢測(cè)大腸桿菌的血清抗性，與傳統(tǒng)的涂板法進(jìn)行比較來(lái)驗(yàn)證其可靠程度及優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 菌株

檢測(cè)的20株大腸桿菌均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院保存菌株。

1.2 血清

血清為SPF雞血清。

1.3 染料

LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。

1.4 涂板法

用接種環(huán)挑取平板上的單菌落，在LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。取500 μL菌液5 000 r/min離心2 min，棄掉上清液，用生理鹽水洗1～2次，重懸于0.9%的生理鹽水，倍比稀釋。再將100 μL細(xì)菌懸液與400 μL血清相混合，37 ℃溫育2 h，分別于0、2 h取樣平板計(jì)數(shù)。平行2次取平均值，計(jì)算2 h與0 h活菌數(shù)比值[10，11]。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)法

血清抗性檢測(cè)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，將大腸桿菌劃線培養(yǎng)，挑取單菌落于液體LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至約108 CFU/mL，然后離心，經(jīng)生理鹽水漂洗2次，并用PBS懸浮、倍比稀釋。將100 μL含有約107 CFU大腸桿菌的稀釋液加入含有SPF雞血清的生理鹽水溶液中（終濃度為10%），37 ℃水浴1 h， 12 000 r/min離心3 min，棄上清，加入500 μL生理鹽水，再加入預(yù)先混合好的染料（A液∶B液=1∶1）1.5 μL，混勻，避光染色15 min，再通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果用活菌數(shù)與全菌體比值。

2 結(jié)果與分析

涂板法計(jì)算使用血清處理前后平板上活菌數(shù)的比值。流式細(xì)胞術(shù)法計(jì)算活菌和全菌體的比值。通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算90%置信區(qū)間，流式細(xì)胞術(shù)法結(jié)果為（0.57，0.75），涂板法結(jié)果為（1.12，8.06）。在流式細(xì)胞術(shù)法中，血清敏感的菌株為1、7、8、14、16、17，中等敏感的菌株為11、15、18、19，血清抗性菌株為2、3、4、5、6、9、10、12、13、20。在涂板法中，血清敏感的菌株為1、7、8、10、11、13、14、15、16、17、18、19、20，中等敏感的菌株為2、3、9、12，血清抗性菌株為4、5、6。流式細(xì)胞術(shù)法95%置信區(qū)間為（0.58，0.78），血清敏感的菌株為1、7、8、14、16、17，中等敏感的菌株為3、11、13、15、18、19，血清抗性菌株為2、4、5、6、9、10、12、20。通過(guò)SPSS軟件分析，二者顯著正相關(guān)（P=0.034<0.05），說(shuō)明流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法是可行的，結(jié)果如表1所示。

3 討論

流式細(xì)胞術(shù)使用的染料是基于PI和SYTO 9的原理對(duì)大腸桿菌進(jìn)行染色，然后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行檢測(cè)。由于血清黏性較大，使用流式細(xì)胞術(shù)的方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，離心及檢測(cè)不易操作，故兩種方法使用的血清濃度不同。但從兩種方法的結(jié)果來(lái)看，使用涂板法檢測(cè)的菌，有5株在血清處理后存活者很少，這幾株菌相對(duì)的流式細(xì)胞術(shù)法檢測(cè)的數(shù)值也較低，但不接近0，這是因?yàn)橥堪宸ㄊ褂玫难鍧舛容^大、作用時(shí)間較長(zhǎng)，故對(duì)大腸桿菌的殺傷程度也較大。通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件分別分析兩種方法得到的結(jié)果90%置信區(qū)間，結(jié)果顯示：流式細(xì)胞術(shù)的血清敏感菌株有6株，中等敏感的有4株，血清抗性的有10株；涂板法血清敏感的有13株，中等敏感的有4株，血清抗性的有3株。但是通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件分析，二者呈顯著正相關(guān)（P=0.034<0.05）。這說(shuō)明，雖然使用的血清濃度不同，但血清對(duì)于大腸桿菌的殺傷作用趨勢(shì)還是一致的。故流式細(xì)胞術(shù)法可以代替涂板法來(lái)進(jìn)行血清抗性的檢測(cè)。計(jì)算流式細(xì)胞術(shù)法95%置信區(qū)間，得到結(jié)果為（0.58，0.78），血清敏感菌株有6株，中等敏感的有6株，血清抗性的有8株。結(jié)果顯示，置信區(qū)間的取值影響菌株血清抗性/敏感的判定。在實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，調(diào)整置信區(qū)間取值。

血清抗性是大腸桿菌毒力的重要組成部分，對(duì)于血清抗性的檢測(cè)，也是檢驗(yàn)大腸桿菌毒力的重要指標(biāo)之一。對(duì)大腸桿菌使用涂板的方法檢測(cè)大腸桿菌對(duì)血清的抵抗能力的方法較為繁瑣，且涂板過(guò)程中容易受到涂得不均勻等因素的影響造成誤差，對(duì)于單菌落的計(jì)數(shù)也比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，但對(duì)實(shí)驗(yàn)器材要求低，價(jià)格便宜。采用流式細(xì)胞術(shù)的方法來(lái)檢測(cè)大腸桿菌的血清抗性，避免了涂板的操作誤差、人工計(jì)數(shù)的誤差，計(jì)算簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便、省時(shí)省力。只是流式細(xì)胞術(shù)的方法需要特殊儀器及染料，價(jià)格相對(duì)昂貴。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃 熙，鄧小玲，黃 瓊，等.2011年德國(guó)O104∶H4腸出血性大腸桿菌感染暴發(fā)疫情報(bào)告[J].中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，45（12）：1133-1136.

[2] 錢 晨，顧 艷，楊建泉.揚(yáng)州市郊區(qū)雞大腸桿菌病的流行病學(xué)調(diào)查及診治[J].中國(guó)家禽，2005，27（18）：27-28.

[3] 湯小敏，呂亞輝.雞大腸桿菌病防治[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2012， 31（5）：125-127.

[4] 榮 祿，鄺.禽病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1997.

[5] BINNS M M，DAVIES D L，HARDY K G.Cloned fragments of the plasmid ColV，I-K94 specifying virulence and serum resistance[J].Nature，1979，279（5716）：778-781.

[6] NOLAN L K，WOOLEY R E，GIDDINGS C W，et al. Characterization of an avirulent mutant of a virulent avian Escherichia coli isolate[J].Avian Diseases，1994，38（1）：146-150.

[7] SALARI S，SALEHI T Z，F(xiàn)ASAEI B N，et al. Construction of an iss deleted mutant strain from a native avian pathogenic Escherichia coli O78∶K80 and in vitro serum resistance evaluation of mutant[J].Iranian Journal of Veterinary Medicine，2014， 8（1）：1-8.

[8] DISSANAYAKE D R A，WIJEWARDANA T G，GUNAWARDENA G A，et al. Distribution of lipopolysaccharide core types among avian pathogenic Escherichia coli in relation to the major phylogenetic group[J].Veterinary Microbiology，2008， 132（s3-4）：355-363.

[9] CHUBA P J，LEON M A，BANERJEE A，et al. Cloning and DNA sequence of plasmid determinant iss，coding for increased serum survival and surface exclusion，which has homology with lambda DNA[J].Molecular & General Genetics Mgg，1989， 216（2-3）：287-292.

[10] 樊 琛，劉桂芹，王 宇，等.雞源致病性大腸桿菌iss基因原核表達(dá)產(chǎn)物的免疫保護(hù)作用[J].畜牧與獸醫(yī)，2010，42（11）：84-86.

[11] 李貴蕭，朱宗濤，康燕青，等.雞大腸桿菌的血清抗性與致病性檢驗(yàn)[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（11）：301-303.