楊妮+蘇偉敏+靳雅慧+王建

摘要：以廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang）嫩葉為材料，采用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)建立和優(yōu)化SSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，對(duì)最適宜退火溫度（Tm）進(jìn)行篩選優(yōu)化，對(duì)17對(duì)已公布的姜黃屬通用性引物進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，篩選出多態(tài)性好、條帶清晰的引物。結(jié)果表明，建立了適合廣西莪術(shù)SSR分析的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，即在15 μL體系中，DNA模板為30 ng/μL，3 μL，Mix（包含DNTP、Mg2+、1×buffer、Taq酶）為5 μL，ddH2O為6 μL，引物為各0.5 μL時(shí)，分析效果較好，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，根據(jù)不同引物的退火溫度復(fù)性30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；反應(yīng)結(jié)束后，4 ℃保存。同時(shí)篩選出在試驗(yàn)材料中能產(chǎn)生較清晰主帶的引物共12對(duì)，初步驗(yàn)證了應(yīng)用SSR分子標(biāo)記分析在廣西莪術(shù)遺傳多樣性的可行性。

關(guān)鍵詞：廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang）；SSR；PCR反應(yīng)體系優(yōu)化；引物篩選

中圖分類號(hào)：R283.6；R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6271-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.067

Abstract： The single factor analysis and orthogonal experimental design were used to establish and optimize SSR-PCR reaction system andprocedures of Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang，and optimum annealing temperature（Tm） optimization. The 17 published universal primers of Curcuma longa L. were used for amplification test，screened polymorphic and clear bands of primers. The results showed that the establishment of a suitable Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang SSR analysis of the reaction system and amplified procedure，namely in 15 μL system，DNA template 30 ng/μL，3 μL，Mix（containing DNTP，Mg2+，1×buffer，Taq enzyme） of 6 μL，ddH2O to 5 μL，primers for the 0.5 μL，the analysis is better，amplification program was 94 ℃ for 5 min，94 ℃ denaturation 30 s，depending on the primer annealing temperature annealing 30 s，72 ℃ extension 1.5 min，35 cycles，and finally 72 ℃ for 5 min，after completion of the reaction，4 ℃ preservation. While filtering out the test material can produce clearer master with a total of 12 primer pairs validated the application of SSR markers in Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang feasibility analysis of genetic diversity.

Key words： Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang；SSR；SSR-PCR reaction system；primers screening

廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S.G.Lee et C.F.Liang）為姜科姜黃屬植物，以干燥根莖入藥，其味辛、苦，性溫，具有行氣破血、消積止痛的作用，是臨床上較為常用的活血化瘀藥物[1]。莪術(shù)揮發(fā)油有較好的抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒作用[2]，尤其在治療腫瘤方面莪術(shù)具有很大的開(kāi)發(fā)潛力[3-5]。廣西莪術(shù)習(xí)稱“桂莪術(shù)”，是廣西主產(chǎn)道地藥材，產(chǎn)區(qū)面積大，是中國(guó)藥典規(guī)定品種，但長(zhǎng)期以來(lái)廣西莪術(shù)的品種選育和改良未受到足夠的重視，廣西莪術(shù)育種側(cè)重于常規(guī)技術(shù)，在分子水平上的研究有待開(kāi)展[6]。近年來(lái)，隨著分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳育種中的應(yīng)用，研究者在藥用植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域已取得顯著成績(jī)[7，8]，其中一個(gè)重要的方向是應(yīng)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究藥用植物的遺傳多樣性、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳連鎖作圖[9，10]。

微衛(wèi)星（Microsatellites）或簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSRs）是以1～6個(gè)堿基為基本單元的串聯(lián)重復(fù)序列，具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、信息含量豐富、共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，是一種較為理想的分子標(biāo)記技術(shù)[11]。近年來(lái)，SSR在藥用植物遺傳育種中成為研究藥用植物遺傳結(jié)構(gòu)，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種和種質(zhì)資源保護(hù)研究的重要工具。由于SSR是一種基于PCR技術(shù)的分子標(biāo)記，其反應(yīng)條件中的諸多因素都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，為保證SSR-PCR的重復(fù)性，建立和優(yōu)化其反應(yīng)體系是十分必要的。本研究主要目的是建立并優(yōu)化一種適用于廣西莪術(shù)SSR分子標(biāo)記研究的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，篩選適用于廣西莪術(shù)遺傳多樣性分析的具有豐富多態(tài)性的SSR引物，以期為加快廣西莪術(shù)SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和分子遺傳育種的研究進(jìn)程奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自廣西南寧市仙湖種植基地的同一批莪術(shù)藥材，4個(gè)有效樣本，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室王建教授鑒定為姜科植物廣西莪術(shù)。

1.2 試劑

2% CTAB提取緩沖液、PVP（聚乙烯吡咯烷酮，BASF）、RNase A；氯仿-異戊醇（24∶1）、平衡酚-氯仿（1∶1）、異丙醇、TE Buffer、無(wú)水乙醇、75%冰醋酸，MixPCR Mix購(gòu)自博瑞克生物技術(shù)公司，試驗(yàn)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器

FA1004型電子天平（上海精科天平儀器廠），Biospec-nano型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（廣州科能儀器設(shè)備有限公司），Mini spin型高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司），9700型PCR擴(kuò)增儀（北京利超興業(yè)科技有限公司）。

1.4 DNA提取方法

取廣西莪術(shù)健康嫩葉0.5～1.0 g，采用改良的CTAB法提取基因組DNA[12]。并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度。所用儀器為島津紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（BioSpec-nano），取DNA樣品1 μL進(jìn)行測(cè)定，檢測(cè)所提取樣品DNA的純度和濃度，再分別計(jì)算產(chǎn)率。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。DNA產(chǎn)率=DNA濃度×提取液體積/原材料質(zhì)量。

1.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)化

1.5.1 引物篩選 所用引物為已公布的姜黃屬17對(duì)通用引物[13]，EST SSR-01～EST SSR-17，引物信息見(jiàn)表1。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.5.2 PCR反應(yīng)體系單因素濃度梯度分析 在其他試驗(yàn)條件一定的情況下，對(duì)PCR反應(yīng)體系的DNA模板濃度、引物用量，2×Taq PCR Master Mix用量進(jìn)行濃度或用量梯度試驗(yàn)，分析不同處理?xiàng)l件對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的影響。反應(yīng)體系濃度梯度見(jiàn)表2。反應(yīng)體系：DNA模板3 μL，Mix（包含DNTP、Mg2+、1×buffer、Taq酶）5 μL，ddH2O 6 μL，引物F、R各0.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。PCR產(chǎn)物擴(kuò)增完成后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.3 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化正交試驗(yàn) 采用L9（34）正交試驗(yàn)（表3），對(duì)DNA模板濃度、引物濃度、2×Taq PCR Master Mix含量進(jìn)行篩選。試驗(yàn)各組合反應(yīng)體系均加ddH2O補(bǔ)足至15 μL。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。正交試驗(yàn)?zāi)軠p少重復(fù)試驗(yàn)次數(shù)，具有方法科學(xué)、試驗(yàn)結(jié)果反映全面情況等優(yōu)點(diǎn)[8]。

1.6 PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化

1.6.1 SSR-PCR擴(kuò)增程序的單因素試驗(yàn) PCR擴(kuò)增程序的關(guān)鍵因素包括變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，對(duì)其進(jìn)行梯度試驗(yàn)，分析不同處理?xiàng)l件對(duì)SSR引物擴(kuò)增結(jié)果的影響（表4）。

1.6.2 SSR-PCR擴(kuò)增程序優(yōu)化的正交試驗(yàn) 擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行設(shè)計(jì)，94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃（按特定引物特定溫度）退火30 min，72 ℃延伸45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。影響SSR-PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵因素變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)作為篩選因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序優(yōu)化選用L16（44）正交試驗(yàn)（表5）。

1.6.3 退火溫度篩選 在建立并優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系基礎(chǔ)上，利用梯度PCR對(duì)退火溫度進(jìn)行優(yōu)化篩選。設(shè)定退火溫度為51、53、55、57、59、61 ℃。

1.6.4 引物多態(tài)性篩選 采用優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增，從17對(duì)公布的姜黃屬通用引物中，初步篩選獲得在試驗(yàn)材料中能產(chǎn)生較清晰條帶的引物，觀察產(chǎn)生多態(tài)性條帶的情況，篩選出能產(chǎn)生多態(tài)性的引物。

1.7 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺凝膠電泳

7%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入3 μL Loading Bufer（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA，0.05%溴酚藍(lán)，0.05%二甲苯青）。每樣品各取1 μL上樣于7%變性聚丙烯酰胺凝膠上，在恒定200 V電泳1.0 h。用掃描儀掃描凝膠，得到分析圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 模板質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)所提取DNA質(zhì)量，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（BioSpec-nano）進(jìn)行檢測(cè)純度和濃度，檢測(cè)結(jié)果表明，試驗(yàn)提取的DNA OD260/OD280值在1.8～2.0之間，濃度在50 μg/mL左右，質(zhì)量符合PCR反應(yīng)需要。

2.2 模板濃度對(duì)PCR體系擴(kuò)增的影響

在SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，DNA模板濃度是一個(gè)重要的影響因子[15]。DNA模板質(zhì)量濃度過(guò)低，無(wú)法擴(kuò)增出清晰條帶或者擴(kuò)增不穩(wěn)定，模板濃度過(guò)高，則出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，均無(wú)法達(dá)到很好的擴(kuò)增效果。本試驗(yàn)設(shè)置了20～60 ng/μL 5個(gè)NDA模板濃度進(jìn)行優(yōu)化，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，模板濃度在20～50 ng/μL時(shí)均可以成功擴(kuò)增出條帶，模板濃度為30、40 ng/μL時(shí)最為穩(wěn)定；當(dāng)模板濃度低于30 ng/μL時(shí)擴(kuò)增條帶較淺，而當(dāng)模板質(zhì)量濃度大于50 ng/μL時(shí)，無(wú)法擴(kuò)增出條帶。因此，在單因素研究中，最佳模板濃度為30～40 ng/μL。

2.3 SSR-PCR正交反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的9個(gè)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，依照SSR-PCR反應(yīng)擴(kuò)增條帶清晰度強(qiáng)弱、出帶情況，得出2、3、4、5反應(yīng)體系擴(kuò)增出的條帶比較清晰（圖2），而反應(yīng)體系2擴(kuò)增效果最優(yōu)。即DNA模板為30 ng/μL，3 μL，Mix（包含DNTP、Mg2+、1×buffer、Taq酶）為5 μL，正反引物各0.5 μL，ddH2O補(bǔ)足至15 μL（即加入ddH2O 6 μL）時(shí)，分析效果較好。

2.4 SSR-PCR 反應(yīng)程序正交試驗(yàn)結(jié)果

SSR-PCR反應(yīng)程序L16（44）正交設(shè)計(jì)的16個(gè)組合擴(kuò)增結(jié)果如圖3所示。隨著變性時(shí)間、退火時(shí)間、延伸時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)的變化組合，不同處理?xiàng)l件下PCR擴(kuò)增條帶的深淺不一，效果參差不齊。結(jié)合前期研究以及正交試驗(yàn)結(jié)果得出反應(yīng)程序6為最佳方案，即變性時(shí)間30 s，退火時(shí)間30 s，延伸時(shí)間45 s，循環(huán)次數(shù)35。

2.5 退火溫度篩選結(jié)果

從圖4可以看出，退火溫度對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增有明顯的影響，退火溫度低于53 ℃時(shí)，主帶不明顯，且擴(kuò)增產(chǎn)生許多淺色的雜帶；當(dāng)退火溫度高于57 ℃時(shí)，擴(kuò)增條帶穩(wěn)定性變差；在退火溫度為55 ℃時(shí)條帶的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好，擴(kuò)增效果較好，這與理論[16]上的值[Tm=2（A+T）+4（G+C）]相一致。因此，選取55 ℃為該引物最佳退火溫度。

試驗(yàn)初期對(duì)多種引物退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)退火溫度53 ℃以下，雜帶多，擴(kuò)增效率差，退火溫度65 ℃以上，則無(wú)法擴(kuò)增出清晰條帶，擴(kuò)增效率下降。而大部分引物在退火溫度為54～56 ℃可以得到清晰具有多態(tài)性的條帶。為了加快廣西莪術(shù)SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)速度，本研究對(duì)引物退火溫度統(tǒng)一設(shè)定為55 ℃。這不僅一定程度上減少了雜帶的干擾，也為了保證引物在不同種質(zhì)中目標(biāo)條帶的擴(kuò)增效率。

2.6 SSR-PCR引物篩選結(jié)果

從姜黃屬17對(duì)SSR引物中初步篩選出14對(duì)可用于廣西莪術(shù)的SSR引物，占全部引物的82.35%，并對(duì)利用這14對(duì)引物對(duì)4份莪術(shù)材料統(tǒng)一進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用優(yōu)化的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序，進(jìn)一步篩選獲得在試驗(yàn)材料中能產(chǎn)生較清晰條帶的引物共有12對(duì)，這些引物是有效引物，適用于廣西莪術(shù)材料。圖5、圖6為引物SSR-01～SSR-16在4種種質(zhì)資源上進(jìn)行PCR擴(kuò)增后掃描得到的電泳圖。

3 小結(jié)與討論

SSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序的建立、優(yōu)化及退火溫度和引物的篩選是SSR多態(tài)性標(biāo)記開(kāi)發(fā)和應(yīng)用的基礎(chǔ)。由于本研究中SSR-PCR反應(yīng)體系所含組分多，且均可能對(duì)擴(kuò)增的特異性、敏感性以及產(chǎn)量變化產(chǎn)生影響，因此建立一套良好的反應(yīng)體系是保證分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)穩(wěn)定性的基礎(chǔ)。SSR反應(yīng)體系優(yōu)化的方法較多，常規(guī)的方法是進(jìn)行多次單因素試驗(yàn)，缺點(diǎn)在于當(dāng)一種組分濃度發(fā)生變化時(shí)，其余幾種組分濃度往往靠經(jīng)驗(yàn)確定，因此難以確定最佳組合[16]。正交試驗(yàn)反應(yīng)體系設(shè)計(jì)可有效地解決單因素試驗(yàn)次數(shù)繁多、工作量大、試驗(yàn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，將各因素、各水平之間的組合均勻搭配、合理安排，同時(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生高度特異靈敏度，因此具有科學(xué)性和可行性。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)，優(yōu)化后的SSR-PCR反應(yīng)體系在后續(xù)SSR分析中得到了驗(yàn)證。

PCR反應(yīng)時(shí)，退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素[17]。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。退火溫度和時(shí)間取決于引物長(zhǎng)度及堿基組成及其濃度，還有序列的長(zhǎng)度[18]。GC含量越高退火溫度越高，引物設(shè)計(jì)時(shí)的Tm值減去5～8 ℃即是引物的退火溫度，本研究設(shè)計(jì)的引物序列長(zhǎng)16～25 bp，G+C含量40%～60%，發(fā)現(xiàn)合適的溫度在55～58 ℃，退火時(shí)間一般是30 s。為了加快試驗(yàn)進(jìn)度，因此將55 ℃做為最理想退火溫度。SSR引物的篩選需要經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增和聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)出帶情況，經(jīng)過(guò)重復(fù)試驗(yàn)，篩選出具有多態(tài)性，條帶清晰的引物，才能滿足種質(zhì)資源多態(tài)性分析要求。

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