馮常輝+張友昌+李國(guó)榮+宋志紅+孟慶忠+金利容+秦鴻德

摘要：利用長(zhǎng)江流域棉花（Gossypium spp.）育種重要親本蘇棉12和荊55173（感黃萎?。┡c抗黃萎病資源Sicala V1和中21373配制兩套感病×抗病雜交組合（蘇棉12×Sicala V1和荊55173×中21373），在其雜交組合的自交子代群體中挑選與黃萎病抗性相關(guān)的9個(gè)SSR（Simple sequence repeat）標(biāo)記實(shí)施分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS）育種。結(jié)果表明，通過(guò)單標(biāo)記選擇，8個(gè)SSR標(biāo)記的aa與AA兩種基因型個(gè)體間的黃萎病校正病情指數(shù)（Correction disease index，CDI）差異達(dá)到極顯著或者顯著水平。利用多元逐步回歸分析得到的單標(biāo)記、雙標(biāo)記以及多標(biāo)記3種篩選方法的效果，結(jié)果表明合理采取多個(gè)有效標(biāo)記同時(shí)篩選能夠提高選擇的準(zhǔn)確度。

關(guān)鍵詞：棉花（Gossypium spp.）；黃萎?。粯?biāo)記輔助選擇育種；簡(jiǎn)單重復(fù)序列

中圖分類(lèi)號(hào)：S562 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）23-6045-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.23.008

Abstract： The self-pollinated progenies derived from two cotton （Gossypium spp.） crosses（Jing55173×Zhong21373 and Sumian12×Sicala V1） of the susceptible cultivars（Sumian12 and Jing55173） and the highly tolerant cultivars（Sicala V1 and Zhong21373） to Verticillium wilt were used for resistance breeding with marker-assisted selection（MAS）. MAS of these progeny populations was put forward by nine simple sequence repeats（SSR） which related to quantitative trait locis（QTL） for Verticillium wilt resistance. For eight of nine SSRs，the difference of correction disease index（CDI） between aa and AA genotype individuals reached either significant or highly significant levels. The effects among single marker， two markers and multi-markers on MAS of cotton were compared using three makers that were selected by multiple stepwise regression analysis， the results showed that selective effects were enhanced through multi-markers way.

Key words： cotton（Gossypium spp.）； Verticillium wilt； marker-assisted selection breeding； simple sequence repeats

黃萎病是棉花（Gossypium spp.）高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙，棉花黃萎病防治問(wèn)題仍舊是世界性難題[1]?？剐云贩N的選育是最有效途徑。然而，抗病性既受環(huán)境條件的影響，又受制于寄主與病原菌之間的互作。育種進(jìn)程勢(shì)必會(huì)因?yàn)檎`判病情而受到耽誤[2]。

分子標(biāo)記輔助選擇（Molecular marker assisted selection，MAS）可以將傳統(tǒng)表型選擇轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯舆x擇基因型[3]。MAS抗病育種在水稻上已有不少成功先例[4]，在小麥[5]、玉米[6]等作物上也有少量成功報(bào)道。MAS育種也在棉花上陸續(xù)開(kāi)展，集中在纖維品質(zhì)、抗蟲(chóng)、抗病方面。郭旺珍等[7]使用MAS聚合了高強(qiáng)纖維QTL（來(lái)源于品系7235）和抗蟲(chóng)基因，培育出新品系南農(nóng)85188。石玉真等[8]利用與高強(qiáng)纖維QTL緊密連鎖的2個(gè)SSR標(biāo)記在不同群體中進(jìn)行MAS，快速改良了sGK321和sGK9708的纖維強(qiáng)度。祁偉彥等[9]對(duì)以中植372為親本的各世代材料，利用黃萎病抗性連鎖SSR標(biāo)記跟蹤檢測(cè)，篩選得到抗性強(qiáng)的后代，進(jìn)而培養(yǎng)出抗病優(yōu)質(zhì)新品種。

湖北省的黃萎病育種受到氣候限制，相對(duì)黃河流域棉區(qū)和新疆棉區(qū)品種而言，湖北省棉花品種對(duì)黃萎病的抗性水平偏低，影響了湖北省高產(chǎn)品種在北方棉區(qū)的推廣使用。本研究試圖在抗病育種程序中，利用連鎖SSR標(biāo)記對(duì)部分已經(jīng)定位的黃萎病抗性QTL進(jìn)行MAS，驗(yàn)證SSR的MAS效果，篩選獲得可以應(yīng)用于棉花黃萎病抗性MAS中的SSR標(biāo)記及其組合，并初步探討影響黃萎病抗性MAS育種效率的因素，為黃萎病抗性的MAS育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

蘇棉12和荊55173是長(zhǎng)江流域棉花育種的重要親本，豐產(chǎn)性和廣適性較好，屬于感黃萎病類(lèi)型；Sicala V1和中21373是從國(guó)外和黃河流域引進(jìn)的抗黃萎病資源。本研究選用上述材料作為親本，配制兩套感病×抗病雜交組合，分別為組合BP1（蘇棉12×Sicala V1）和組合BP2（荊55173×中21373）（圖1）。BP1F1和BP2F1連續(xù)自交，各自獲得不同世代，包括F2、F3、F4、F5。

1.2 黃萎病抗性鑒定

黃萎病抗性鑒定試驗(yàn)采用2種不同方式，并設(shè)置3次重復(fù)。溫室里利用傷根接菌的方法鑒定黃萎病抗性。當(dāng)棉苗長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，使棉苗外圍根系受到損傷（傷根程度盡量一致）后定量注射濃度2.48×107個(gè)/mL、具有中致病力的黃萎病菌液（病原菌從湖北省天門(mén)市發(fā)病棉區(qū)采集后分離出單菌落）18 mL。然后置于溫度為27 ℃，光/暗條件為16 h/8 h的溫室里繼續(xù)培養(yǎng)，定期澆水保持一定濕度。接菌后第30天，棉苗黃萎病病情逐漸穩(wěn)定，第33天進(jìn)行病情調(diào)查。大田里采用人工接種黃萎病菌的方式。移栽時(shí)先將營(yíng)養(yǎng)缽置于濃度為1.03×107個(gè)/mL黃萎病液中浸泡，再移栽至大田。

1.3 抗病性調(diào)查

棉花黃萎病發(fā)病級(jí)別按0～4級(jí)劃分成5級(jí)[10]。感病對(duì)照為冀棉11。校正病情指數(shù)（Correction disease index，CDI）=個(gè)體實(shí)際病情指數(shù)×50.00/感病對(duì)照實(shí)際病情指數(shù)。其中，實(shí)際病情指數(shù)=Σ（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總株數(shù)×4）×100。病級(jí)（Disease grade，DG）=Σ（各級(jí)病株數(shù)×該病級(jí)值）/調(diào)查總株數(shù)。

1.4 SSR標(biāo)記和基因型檢測(cè)

DNA抽提采用改良的CTAB法[11]。SSR標(biāo)記的擴(kuò)增、電泳和染色程序參照孔祥瑞等[12]和張軍等[13]的方法。為了便于統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)于共顯性標(biāo)記，電泳條帶與中21373相同時(shí)，個(gè)體基因型記作AA，否則記作Aa或aa；對(duì)于顯性標(biāo)記，電泳條帶與中21373相同時(shí)，個(gè)體基因型記作Aa，否則記作aa。從已報(bào)道的36個(gè)黃萎病抗性相關(guān)SSR標(biāo)記[14-19]中，選擇在2個(gè)群體的4個(gè)親本中具有多態(tài)性的9個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行MAS。其中標(biāo)記BNL1053檢測(cè)到2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別記作BNL1053-1和BNL1053-2（表1）。

1.5 黃萎病抗病性狀的SSR標(biāo)記輔助選擇

子代群體BPF2（共680個(gè)）依照大田產(chǎn)量（主要考察結(jié)鈴性）初步選擇之后得到BPF3（含75個(gè)株行）。然后在海南繁殖加代得到BPF4。本輪標(biāo)記輔助選擇過(guò)程通過(guò)比較個(gè)體不同位點(diǎn)基因型與抗病親本基因型差異，淘汰差異十分明顯的個(gè)體。BPF5利用SSR標(biāo)記著重選育抗或者較抗黃萎病的材料（圖1）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

使用DPS軟件進(jìn)行相關(guān)分析和多元逐步回歸分析，利用Excel 2003進(jìn)行t檢驗(yàn)。溫室能為棉苗發(fā)病創(chuàng)造良好的發(fā)病條件[20]，其鑒定結(jié)果比大田更穩(wěn)定，因此回歸分析對(duì)象定為個(gè)體校正病情指數(shù)（YCDI），因子為SSR標(biāo)記（見(jiàn)1.4）基因型值（Xmarker）。其中，AA、Aa和aa 3種基因型分別賦值為“2”、 “1” 和“0”。根據(jù)擬合模型中所保留的因子數(shù)命名為擬合模型1～8。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃萎病抗性鑒定結(jié)果

該育種群體抗病性狀變異程度較大，病情離散分布。田間抗病性狀變異程度略低于室內(nèi)（表2）。另外，方差分析結(jié)果也表明BPF4個(gè)體之間的抗病性差異極顯著（表3）。

2.2 連鎖SSR標(biāo)記與黃萎病抗性的多元逐步回歸分析

用于MAS的9個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)的基因型值（Xmarker）對(duì)校正病情指數(shù)（YCDI）產(chǎn)生極顯著的負(fù)向影響（表4）。經(jīng)逐步回歸分析法扣除其中1～8個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)的影響，建立Xmarker與YCDI的擬合模型。當(dāng)扣除6個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)時(shí)，YCDI與擬合模型中的各個(gè)因子的偏相關(guān)系數(shù)（r）全部達(dá)到顯著水平，而且其調(diào)整相關(guān)系數(shù)（Ra）為0.71，也十分接近最高值0.72，直觀地反映了XNAU1167、XNAU5467、XNAU3053對(duì)黃萎病YCDI產(chǎn)生更重要的影響。因此確定YCDI=47.036 481 7-8.245 074 816 XNAU1167-4.120 554 754 XNAU5467-4.587 778 119XNAU3053為較優(yōu)擬合模型。

2.3 單標(biāo)記對(duì)黃萎病抗性選擇的效果

利用NAU1167、NAU3053、NAU1225、NAU5428、NAU2859、NAU5120共6個(gè)標(biāo)記中任一標(biāo)記篩選后，基因型aa與AA類(lèi)型間CDI差異均達(dá)到極顯著水平（表5）。利用NAU5467和BNL1053-1兩個(gè)標(biāo)記中任一標(biāo)記篩選后，基因型aa與AA類(lèi)型間差異僅達(dá)到顯著水平。標(biāo)記NAU1167、NAU5467、NAU3053在DNA電泳檢測(cè)時(shí)表現(xiàn)為共顯性，根據(jù)不同個(gè)體的標(biāo)記基因型能將BPF4及其親本分為3類(lèi)，分別屬于aa（a1a1、a2a2、a3a3）、Aa（A1a1、A2a2、A3a3）和AA（A1A1、A2A2、A3A3）基因型。標(biāo)記NAU5467在基因型aa與Aa類(lèi)型間進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)時(shí)不顯著，但是在aa與AA類(lèi)型間達(dá)到顯著水平，同時(shí)在AA與Aa類(lèi)型間達(dá)到極顯著水平。標(biāo)記NAU1167和NAU3053在不同類(lèi)型之間進(jìn)行t測(cè)驗(yàn)時(shí)都達(dá)到極顯著水平。

2.4 雙標(biāo)記、多標(biāo)記對(duì)黃萎病抗性選擇的效果

BPF4及其親本經(jīng)NAU1167/NAU5467、NAU1167

/NAU3053、NAU5467/NAU3053雙標(biāo)記篩選后，aaaa與AAAA類(lèi)型間個(gè)體黃萎病CDI的差異都達(dá)到極顯著水平（表5）。經(jīng)三標(biāo)記同時(shí)篩選后，aaaaaa與AAAAAA類(lèi)型間個(gè)體黃萎病CDI的差異達(dá)到極顯著水平，而且其均值差為25.54，大于單標(biāo)記和雙標(biāo)記選擇結(jié)果。經(jīng)單標(biāo)記篩選后，aa與AA類(lèi)型間CDI的均值差明顯低于雙標(biāo)記選擇；經(jīng)雙標(biāo)記篩選后，aa與AA類(lèi)型間CDI的均值差低于多標(biāo)記選擇。由此可見(jiàn)，當(dāng)不同標(biāo)記用于黃萎病抗性輔助選擇時(shí)，同時(shí)運(yùn)用多個(gè)有效標(biāo)記進(jìn)行選擇能夠提高選擇的準(zhǔn)確度。

2.5 標(biāo)記組合對(duì)大田黃萎病抗性選擇的效果

綜合以上分析結(jié)果篩選到最優(yōu)標(biāo)記組合為NAU1167/NAU5467/NAU3053。利用該標(biāo)記在大田進(jìn)行黃萎病抗性選擇后，得基因型a1a1a2a2a3a3的DG值為3.60，A1A1A2A2A3A3的DG值為2.13，兩者之間的均值差為1.47，抗感兩基因型間差異達(dá)極顯著水平?？剐暂^好的個(gè)體總體表現(xiàn)與感病對(duì)照相比，病級(jí)相差0.77。說(shuō)明該標(biāo)記組合的輔助選擇效果在大田依然能夠保持。盡管如此，由于其個(gè)體數(shù)都較少，因此還需作后續(xù)驗(yàn)證。

3 討論

3.1 棉花黃萎病抗性輔助選擇中有效分子標(biāo)記的篩選

由于不同研究間存在材料遺傳背景、發(fā)病環(huán)境條件、圖譜標(biāo)記密度等差異，定位結(jié)果間一致性較差。除此之外，僅僅通過(guò)作圖群體估算的QTL效應(yīng)仍有待驗(yàn)證。本次研究涉及黃萎病相關(guān)SSR標(biāo)記僅有部分在MAS育種上得到驗(yàn)證。標(biāo)記NAU5428、NAU1167、NAU5467、NAU2859均未見(jiàn)其應(yīng)用于棉花黃萎病抗性MAS的報(bào)道。NAU5120和BNL1053已經(jīng)被試圖應(yīng)用于MAS中，并未達(dá)到預(yù)期效果[21]。標(biāo)記NAU3053和NAU1225已經(jīng)被應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助聚合陸地棉抗黃萎病QTL中，獲得的材料聚合了多個(gè)QTLs，其抗病性與對(duì)照5026相比顯著增強(qiáng)[16]。

QTL定位結(jié)果能否應(yīng)用于實(shí)際育種中，首先需要解決其連鎖標(biāo)記是否有效的問(wèn)題。構(gòu)建群體BP的最終目標(biāo)是獲得產(chǎn)量高、黃萎病抗性與抗源親本相當(dāng)?shù)馁Y源材料。因此，在此類(lèi)群體中實(shí)施黃萎病連鎖SSR標(biāo)記輔助選擇，比較標(biāo)記選擇和接菌鑒定結(jié)果，評(píng)價(jià)各個(gè)標(biāo)記輔助選擇的效果。效果佳的SSR標(biāo)記被他人直接利用后，MAS仍然見(jiàn)效。

3.2 影響黃萎病抗性輔助選擇育種效率的因素

QTL效應(yīng)大小及其與側(cè)翼標(biāo)記的遺傳距離是影響MAS順利、準(zhǔn)確進(jìn)行的主要因素。黃萎病抗性相關(guān)QTL分為主效和微效兩種類(lèi)型。李志坤等[22]利用來(lái)源于Pima90-53中的SSR標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，160個(gè)BC1F1代單株材料中，平均檢出率達(dá)到84.0%，還發(fā)現(xiàn)少許單株雖然有抗病標(biāo)記但是表現(xiàn)感病。推斷是由于標(biāo)記BNL3255與目標(biāo)QTL連鎖不夠緊密所致（其遺傳距離為13.7 cM）?？紫槿鸬萚12]采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將與陸地棉黃萎病抗性相關(guān)的18個(gè)SSR標(biāo)記用于大田輔助選擇育種，其中的3個(gè)連鎖SSR標(biāo)記BNL2865、BNL1721、BNL3452的貢獻(xiàn)率分別達(dá)到3.06%、13.89%、8.28%，并依據(jù)標(biāo)記基因型分組的CDI結(jié)果推測(cè)BNL2865在MAS上無(wú)效。本研究中，BPF4及其親本經(jīng)標(biāo)記BNL1053-1篩選后，抗感兩種類(lèi)型的CDI僅達(dá)到顯著水平；而經(jīng)BNL1053-2篩選后達(dá)不到顯著水平。推測(cè)前者確實(shí)與黃萎病QTL連鎖，只是連鎖距離偏大，超過(guò)5 cM；后者與黃萎病性狀可能無(wú)關(guān)聯(lián)。此結(jié)果與前人研究結(jié)果基本一致，再次表明該標(biāo)記不適用于棉花黃萎病抗性MAS[21]。標(biāo)記NAU3053和NAU1167可解釋黃萎病抗性變異的百分率較高，并且比NAU5467高。經(jīng)標(biāo)記NAU3053和NAU1167篩選后，抗感兩種類(lèi)型的CDI均能達(dá)到極顯著水平，經(jīng)標(biāo)記NAU5467篩選后，抗感兩種類(lèi)型的CDI只能達(dá)到顯著水平。從一定程度上表明了挑選與效應(yīng)較大QTL相關(guān)標(biāo)記是提高黃萎病抗性MAS育種效率的重要途徑。

棉花抗黃萎病相關(guān)QTL或其緊密連鎖標(biāo)記間的相斥和相引連鎖關(guān)系也是影響MAS效率的因素之一。NAU1225是通過(guò)江蘇棉區(qū)培育的品系60182檢測(cè)出的黃萎病抗性連鎖標(biāo)記，其連鎖距離小[14]，而在育種群體BPF4中進(jìn)行輔助選擇的相對(duì)效果不太明顯，可能是連鎖相改變引起的。只有在徹底了解其遺傳機(jī)制的基礎(chǔ)上，才能使MAS目標(biāo)更明確。

未知QTL也是影響MAS效率的因素之一。多元逐步回歸分析得到Ra范圍為0.65～0.72，由此反映抗病性受其他未知QTL（解釋的變異至少占28%）的影響。

育種實(shí)踐中為選擇到理想、優(yōu)良的資源材料，大多需擴(kuò)大群體數(shù)量。欲開(kāi)展大規(guī)模MAS成本很高，但合理減少標(biāo)記可以使其成本大幅下降。依據(jù)育種目標(biāo)對(duì)連鎖標(biāo)記進(jìn)行細(xì)致篩選，以運(yùn)用最少的標(biāo)記達(dá)到較為理想的選擇效果[23]。為簡(jiǎn)化標(biāo)記檢測(cè)過(guò)程，在此應(yīng)忽略回歸分析中相關(guān)系數(shù)低的標(biāo)記的選擇作用，例如，標(biāo)記NAU1225、NAU5428、NAU2859雖然能解釋相對(duì)較大的黃萎病抗性變異或者與抗病性存在較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)，但因其R低于其余6個(gè)標(biāo)記，也會(huì)被剔除。標(biāo)記NAU5120和NAU3053同在D7染色體上，距離17.0 cM，二者可能與相同的QTL連鎖。為避免MAS中標(biāo)記的選擇作用重疊，優(yōu)先選用其中篩選效果更佳的標(biāo)記NAU3053。綜上所述，最終挑選出3個(gè)SSR標(biāo)記（NAU3053、NAU1167和NAU5467）建立Xmarker與YCDI的擬合模型。

QTL/基因定位方法的不斷革新以及棉花基因組圖譜的日趨完善將使MAS現(xiàn)存的諸多問(wèn)題不斷得到解決。近年來(lái)全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）成為遺傳育種領(lǐng)域的熱點(diǎn)。GWAS直接利用基因本身或基因附近微小區(qū)域的分子標(biāo)記與性狀表型的關(guān)聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)基因的精細(xì)定位[24]?；赟NP標(biāo)記的GWAS所定位的QTL解釋表型變異率高，可增強(qiáng)MAS的目的性和準(zhǔn)確性。陸地棉基因組測(cè)序的完成，極大地推動(dòng)了棉花的遺傳改良和基礎(chǔ)生物學(xué)研究[25]。快速、高通量分型技術(shù)——SNP芯片的應(yīng)用，有助于基因精細(xì)定位以及克隆，發(fā)掘SNP位點(diǎn)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，尋找與黃萎病相關(guān)QTL/基因緊密連鎖的SNP標(biāo)記，設(shè)計(jì)配套的MAS最佳方案，勢(shì)必成為真正實(shí)現(xiàn)棉花黃萎病MAS育種快速高效的突破口。

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