樊淑華，王永立

(1.周口師范學院生命科學與農(nóng)學學院，河南周口 466001; 2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

CD8+T細胞表位鑒定技術研究進展

樊淑華1,2，王永立1

(1.周口師范學院生命科學與農(nóng)學學院，河南周口 466001; 2.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，北京 100193)

CD8+T細胞表位通過MHCⅠ分子呈遞到細胞表面，激活CTL細胞從而介導并調(diào)節(jié)機體抗內(nèi)源性抗原的免疫應答。MHC-peptide穩(wěn)定性試驗通過TAP缺陷的RMAS細胞轉(zhuǎn)染克隆在細胞水平鑒定CD8+T細胞表位與MHCⅠ分子的親和力；酶聯(lián)免疫斑點技術(ELISPOT)通過檢測IFN-γ的分泌水平評估抗原免疫后機體的細胞免疫應答能力，具有較高的敏感性和高效性。四聚體技術通過流式細胞儀分析抗原特異性CD8+T細胞的表型和功能特征。論文介紹 了CD8+T細胞表位的特征和上述3種表位鑒定方法的基本原理和研究進展，為 CD8+T細胞表位的鑒定和表位疫苗的研制提供參考。

T細胞表位；CD8+T細胞；表位預測；表位鑒定

CD8+T細胞表位是內(nèi)源性抗原經(jīng)抗原提呈細胞(antigen presentation cell,APC)處理后，由主要組織相容性復合體 MHCⅠ(major histocompatibility complex class Ⅰ)分子遞呈到細胞表面，供CD8+T細胞受體(T cell receptor，TCR) 識別的表位。細胞毒性T淋巴細胞 (cytotoxic T lymphocytes，CTL) 是CD8+T細胞的主要功能亞群。CTL免疫應答在機體抵抗胞內(nèi)微生物感染和腫瘤發(fā)生的過程中起著重要作用，是機體發(fā)揮特異性細胞毒作用的主要效應細胞[1]。由于TCR對抗原的識別具有MHC限制性，CD8+T細胞受體只識別MHCⅠ分子遞呈的表位肽[1]，這為CD8+T細胞表位研究提供了重要的理論基礎。目前，研究T細胞表位的常用技術手段包括基于氨基酸序列或結(jié)構(gòu)的表位預測、酵母雙雜交[2]、噬菌體展示庫[3]、MHC-肽四聚體[4]、快速蛋白液相色譜、圓二色譜、X-射線衍射和核磁共振等方法[5]。中國農(nóng)業(yè)大學進化免疫學實驗室通常按照以下3個主要程序篩選和鑒定動物病毒的CD8+T細胞表位：①首先根據(jù)抗原序列或抗原結(jié)構(gòu)進行免疫優(yōu)勢表位的分析及合成；②將表位肽與MHC分子進行體外共復性，通過快速蛋白液相色譜和圓二色譜檢測多肽與MHC分子的親和力；③通過細胞學試驗、酶聯(lián)免疫斑點技術 (enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT ) 和四聚體技術鑒定表位多肽的生物學功能。本文著重從以上3個方面， 對CD8+T細胞表位分析鑒定技術的與原理和進展進行了論述。

1 CD8+T細胞表位的呈遞和基本特征

根據(jù)T細胞表面CD4和CD8分子的表達，可將成熟的T細胞分為CD4+T細胞和CD8+T細胞。其中CD8+T細胞主要以 MHCⅠ類分子限制性方式識別靶細胞表面的特異性抗原，是機體發(fā)揮特異性細胞毒作用的主要效應細胞[1]。內(nèi)原性抗原蛋白被細胞基質(zhì)和細胞核中的蛋白酶體降解成多肽片段,被轉(zhuǎn)運相關蛋白酶體(transporter associated with antigen processing，TAP)運送到粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(rough endoplasmic reticulum，RER)內(nèi)與新合成的MHCⅠ類分子結(jié)合形成抗原肽-MHC Ⅰ復合物(peptide-MHCⅠ-β2m，pMHCⅠ)。pMHCⅠ復合物在RER內(nèi)與輕鏈(β2 microglobulin，β2m)組裝在一起，經(jīng)高爾基體轉(zhuǎn)運到細胞表面被CD8+T細胞所識別，發(fā)揮細胞免疫應答效應，這個過程叫做抗原的呈遞。相反，如果多肽與MHCⅠ分子在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中不能結(jié)合，則返回到細胞溶質(zhì)中進行降解[6-7]。

分子生物學及結(jié)構(gòu)免疫學技術的發(fā)展加深了人們對MHCⅠ分子及CD8+T細胞表位的認識。MHC Ⅰ分子由重鏈α和輕鏈β2m共同構(gòu)成，重鏈胞外部分具有3個結(jié)構(gòu)域，即α1、α2、α3，β2m通過非共價作用力與α鏈結(jié)合。α1和α2共同形成多肽結(jié)合槽,MHCⅠ分子通過多肽結(jié)合槽結(jié)合、呈遞多肽表位。多肽結(jié)合槽內(nèi)與多肽結(jié)合緊密的凹陷，被稱為口袋，從N端到C端可以劃分成A～F 6個口袋。一般來講，B、F口袋(有些是B、C、F或者B、D、F)決定了MHCⅠ傾向于結(jié)合哪種性質(zhì)的多肽序列。能夠結(jié)合到以上口袋中多肽上的氨基酸被稱為錨定殘基[8]。由于MHCⅠ多肽結(jié)合槽兩端呈封閉狀，CD8+T細胞表位相對較短，一般為8肽～11肽。多肽表位的構(gòu)象通常為M型[9]，但有些表位呈現(xiàn)特殊的雙M型構(gòu)象，即其第4、6、8位氨基酸殘基伸出多肽結(jié)合槽外以結(jié)合TCR，第2、5、9位氨基酸殘基插入多肽結(jié)合槽，并與多肽結(jié)合槽內(nèi)的氨基酸形成不同的相互作用力[10]。這些結(jié)構(gòu)學方面的信息和CD8+T細胞表位特征為細胞表位的預測分析和試驗鑒定提供了理論依據(jù)。

2 T細胞表位預測方法

生物信息學預測T細胞表位的方法主要分為基于序列的預測方法和基于結(jié)構(gòu)的預測方法[11-12]。其中基于序列的預測方法主要通過序列同源性分析，通過MHCⅠ分子與病毒表位的結(jié)合閾值預測表位的親和力，常用網(wǎng)站包括NetMHCpan2.8server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan-2.8/) 和SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)[13-14]。基于結(jié)構(gòu)的預測方法是利用MHC Ⅰ分子的晶體結(jié)構(gòu)及蛋白-多肽相互作用的具體信息來模建3D 模型，通過分析其三維構(gòu)象和多肽結(jié)合槽特征，并結(jié)合相似構(gòu)象的MHCⅠ限制性T細胞表位來預測新的表位。但通過生物信息學方法進行多肽篩選存在較多的假陽性[15]，需要通過進一步的生物學試驗對多肽的生物學功能進行鑒定。

3 CD8+T細胞表位的鑒定

體外共復性試驗是目前常用的CD8+T細胞表位的鑒定方法，該方法將表位肽與相應MHC分子進行體外共復性，通過快速蛋白液相色譜 (fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC)和圓二色譜技術來檢測多肽與MHC分子的親和力。如Fan S等[5]應用分子篩和離子交換色譜技術鑒定了黑山豬HLA-3*hs0202結(jié)合A型流感病毒的CD8+T細胞表位。該方法可實現(xiàn)對預測T細胞表位的高通量鑒定，但無法確定表位的體內(nèi)生物學活性。因此，常常需要通過細胞學試驗或動物試驗鑒定多肽的功能。

3.1 MHC-peptide穩(wěn)定性試驗

MHC-peptide穩(wěn)定性試驗是用來檢測某一多肽對細胞表面MHC分子親和力的研究。該方法應用TAP缺陷的細胞系如人類的T2細胞或變異的小鼠淋巴瘤細胞系 (Rauscher virus induced mouse antigen processing-defective mutant cell line-ethylmethane sulphonate, RMA-S)來檢測pMHC的穩(wěn)定性。由于TAP缺陷，T2細胞和RMA-S細胞內(nèi)源性多肽不能轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，不能與MHC分子進行組裝并轉(zhuǎn)運到細胞表面，所以細胞表面空載的MHC分子表達極不穩(wěn)定，表達后很快被降解[16]。但是，在外源性多肽的作用下，細胞表面的pMHC復合物能夠穩(wěn)定表達于細胞表面，抗原肽與MHC的結(jié)合力越強，則細胞表面MHC分子的降解就越少，表現(xiàn)為表達量越高。結(jié)果可通過間接免疫熒光法檢測，兩者結(jié)合越穩(wěn)固，可檢測到的MHCⅠ類分子越多，最終以平均熒光強度為檢測指標，以熒光系數(shù)作為衡量指標[17]。

近年來，MHC-peptide穩(wěn)定性試驗在人及動物病毒CD8+T細胞表位的鑒定中廣泛應用。2010年，Macdonald IK等將真核表達的牛N*01301- pcDNA6轉(zhuǎn)染到細胞中，并應用該細胞系對牛的免疫優(yōu)勢表位(Tp1214-224：VGYPKVKEEML)進行了生物學特性的研究，證明多肽第5位(Lys)和第11位(Leu)為決定多肽功能的關鍵位點[17]。2012年，Ross P等[18]將狗的MHC分子 DLA-88*50801 轉(zhuǎn)染到 RMA-S 細胞中，通過G418抗性篩選到了1株穩(wěn)定表達DLA-88*50801基因的克隆BARC3，并應用BARC3細胞成功篩選了DLA-88*50801限制性CD8+CTL表位。研究結(jié)果表明，外源多肽可以穩(wěn)定RMA-S細胞表面MHC分子的組裝和表達，且細胞外異種β2m能使低溫培養(yǎng)的的RMA-S細胞表面的MHCⅠ分子表達量增加，低溫(19℃～33℃)更有利于MHC復合體的組裝。通過 MHC-peptide穩(wěn)定性試驗可以從細胞學水平證明多肽表位能否被相應 MHCⅠ分子呈遞到細胞表面，以發(fā)揮其細胞免疫的功能。

3.2 酶聯(lián)免疫斑點技術

酶聯(lián)免疫斑點技術將細胞培養(yǎng)技術與酶聯(lián)免疫吸附(ELISA試驗)相結(jié)合，能夠在單細胞水平檢測細胞因子的分泌情況。其原理是用抗體捕獲培養(yǎng)中細胞所分泌的細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色的方式將其表現(xiàn)出來[19]。試驗設計在96孔培養(yǎng)板上進行，培養(yǎng)板預先包被特異性的單克隆抗體，以捕獲細胞分泌的細胞因子，再加入生物素包被的第二抗體和辣根過氧化物酶標記的鏈酶親和素，最后加入底物，就可以在膜的局部形成一個個圓形的斑點。根據(jù)膜上斑點的數(shù)目，再除以當初加入孔內(nèi)的細胞總數(shù)，就可以計算出陽性細胞的頻率。

ELISPOT技術通過體外檢測CD8+T細胞因子的分泌水平，來評估抗原免疫后機體的細胞免疫應答能力，該方法可實現(xiàn)對T細胞表位肽的的高通量篩選和鑒定[20]。如Schultheis K等[21]應用ELISPOT技術檢測了DNA疫苗免疫后機體特異性細胞應答水平，并鑒定了一些蛋白免疫優(yōu)勢T細胞表位。Assarsson E 等[15]預測了23個A型流感病毒株的4 000 個表位肽，通過ELISPOT技術鑒定了這些多肽與人類MHC(human leucocyte antigen，HLA)超級型之間的親和力，鑒定出54個能夠與不同HLA分子結(jié)合的保守流感表位，為通用流感表位疫苗的研制提供了依據(jù)。Diaz I等[22]應用生物信息學方法預測了歐洲Ⅰ型PRRSV GP4、GP5和N蛋白的T細胞表位，并采用ELISPOT試驗鑒定出PRRSV N 蛋白和GP4蛋白的5條免疫優(yōu)勢T細胞表位，證明N蛋白與GP4和GP5蛋白相比，在細胞免疫應答中具有更重要的作用。Lima-Junior J C等[23]應用ELISPOT技術檢測了巴西西北部的亞馬遜森林區(qū)142人外周血淋巴細胞內(nèi)的IFN-γ和IL-4水平，鑒定了間日瘧原蟲表面蛋白(Plasmodiumvivaxmerozoite surface protein ，PvMSP9) 的免疫優(yōu)勢T細胞表位。Eickhoff C S等[24]通過ELISPOT技術鑒定了32個HLA-A2 限制性克氏錐蟲(Trypanosomacruzi)CD8+T細胞表位。

通過ELISPOT技術檢測機體內(nèi)細胞因子(IFN-γ和IL-4)產(chǎn)生的水平是評估病原感染后細胞免疫應答能力的關鍵，也是評估多肽免疫原性的依據(jù)。通過ELISPOT技術鑒定多肽的生物學活性，為新型表位疫苗的研制提供了數(shù)據(jù)支持。

3.3 四聚體技術

四聚體技術是基于MHC-抗原肽復合物與T細胞表面受體(TCR)相互作用的原理而設計的。由于MHC-抗原肽與TCR的親和力低且解離速度快[25]，不能在細胞表面形成穩(wěn)定的復合物，因此不適于抗原特異性T細胞的分析。1996年，Altman J D等[26]發(fā)明了MHC/多肽四聚體技術并將其應用于人類免疫缺陷病毒抗原肽特異性CTL的檢測中獲得成功。該技術借助生物素-親和素級聯(lián)反應放大原理，將4個生物素化后的 MHCⅠ-肽復合物與1個鏈酶親和素結(jié)合作為 TCR 識別的配體，增強了MHC-多肽與TCR的親和力，并提高了反應的特異性。同時，將四聚體進行熒光標記，應用流式細胞儀可將抗原特異性的T細胞檢測并分離出來，提高了靈敏度。

目前，四聚體技術在抗胞內(nèi)微生物免疫領域主要用于抗原特異性T細胞免疫應答的監(jiān)控和T細胞表位的篩選。如 Wu Y等[27]構(gòu)建了 HLA-A*02乙型肝炎病毒(HBV) 肽四聚體，用于檢測乙型肝炎病人外周血中HBV 特異性 CTL細胞，證明利用四聚體技術可對外周血中病毒特異性T淋巴細胞水平進行評估，從而驗證多肽的的生物學功能。Chiu C等[28]應用四聚體技術鑒定了人HLA-A*0201限制性水痘-帶狀皰疹病毒(Varicella zoster virus，VZV) 的一個免疫優(yōu)勢CD8+T細胞表位，分析了多肽特異性CD8+T細胞的功能，并證明了該表位對α皰疹病毒(HSV-1、HSV-2)和β皰疹病毒具有交叉免疫性，為保守的病毒特異性表位疫苗的研制提供了依據(jù)。

另外，該技術在寄生蟲T細胞表位的研究中也得到了廣泛的應用。Svitek N等[29]報道了牛MHCⅠ(bovine leukocyte antigens，BoLAⅠ)四聚體的應用，將7個不同的BoLAⅠ分子與來自泰勒氏蟲(Theileriaparva，Tp)5種不同抗原的7個表位同時制備了四聚體復合物，并應用該四聚體復合物檢測了免疫15 d～17 d后牛外周血中表位特異性T細胞，發(fā)現(xiàn)多肽表位Tp587-95 特異性CTL可同時識別Tp5-BoLA-1*02301和Tp5-BoLA-T5兩種四聚體，從而證明了多肽表位Tp587-95可被不同的BoLA Ⅰ分子呈遞。Lasso P等[30]通過四聚體技術檢測了錐蟲病感染病人體內(nèi)的雙陽性T淋巴細胞，評估了克氏錐蟲 KMP-11 蛋白中的保守九肽(Tc TLE)誘導HLA-A2、HLA-A24 和HLA-A1 3個MHC超級型人群中的CD8+T細胞免疫應答的能力，鑒定了Tc TLE多肽的生物學功能。Sanecka A等[31]制備了剛地弓形蟲Ld -Gra6四聚體，鑒定了弓形蟲急性和慢性感染期CD8 T細胞免疫優(yōu)勢表位。

MHCⅠ四聚體技術可以通過流式細胞儀直接對特異性CTL 進行定量、定性分析，提高了檢測的靈敏度和特異性，是目前檢測抗原特異性CTLs 的金標準。本課題組致力于動物MHCⅠ類分子四聚體的研究，利用四聚體技術更好地篩選抗胞內(nèi)微生物的CD8+T 細胞表位多肽，并希望在牛源寄生蟲病多肽疫苗的研制方面取得突破。

4 展望

目前，疫苗免疫仍是機體抵御病毒和胞內(nèi)寄生蟲感染的有效措施。然而還有許多病原生物至今還缺乏有效的疫苗，如人畜共患隱孢子蟲病[32-33]。細胞表位疫苗在預防腫瘤及開發(fā)免疫治療性疫苗方面已顯露出廣闊的應用前景。隨著結(jié)構(gòu)生物學及免疫學技術的成熟，多種T細胞表位的預測和鑒定方法也隨之建立起來。四聚體和ELISPOT技術以其高效和高通量的優(yōu)勢逐漸成為免疫學基礎研究與新型疫苗開發(fā)的常規(guī)手段。但由于T細胞表位分子質(zhì)量較小，免疫原性較弱，如何提高其免疫原性是表位疫苗研究的關鍵。將不同類型的保守T細胞表位進行融合構(gòu)建通用型表位疫苗、開發(fā)新型免疫佐劑以提高表位疫苗的免疫原性是表位疫苗研究的重要方向。本文圍繞細胞表位的預測與鑒定技術，闡述了CD8+T細胞表位研究的現(xiàn)狀，希望對T細胞表位的鑒定及T細胞表位疫苗的研制提供參考。

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Abstract:CD8+T cell epitopes submitted by MHCⅠ molecules can stimulate CTL cells,and play a crucial role in mediating and regulating immunoreactions against endogenous antigens.The binding of peptides to MHCI molecule could be detected using a stably transfected clone of TAP-deficient RMA-S; The IFN-gamma secretory ELISPOT (enzyme-linked immunospot) assay was found to be more sensitive and cost-effective compared to other methods and widely used on the detection of cell immune responses to immunization; Flow cytometry was used to examine the surface markers and biological function of antigen-specific CD8+T cell with MHC class Ⅰ peptide tetramers.This article reviewed the latest progress on the three techniques of experimental identification of CD8+T cell epitopes and its application for facilitating the development of epitope vaccines.

Keywords:T cell epitope; CD8+T cell; epitope prediction; epitope mapping

ProgressonCD8+TCellEpitopeMappingTechniques

FAN Shu-hua1,2,WANG Yong-li1

(1.CollegeofLifeScienceandAgronomy,ZhoukouNormalUniversity,Zhoukou,Henan,466001,China; 2.CollegeofVeterinaryMedicine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

S852.43

A

1007-5038(2017)08-0085-05

2017-01-16

國家863計劃項目 (2013AA102503)；河南省科技廳科技發(fā)展計劃項目(162102310587)；周口師范學院高層次人才啟動項目 (700-70161)

樊淑華(1980-)，女，河南商丘人，講師，博士，主要從事分子免疫學研究。