張玉明

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002）

凝結(jié)芽孢桿菌在乳酸生物煉制中的應(yīng)用

張玉明

(河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定071002）

乳酸是一種重要的有機酸，利用木質(zhì)纖維素生物煉制乳酸已經(jīng)成為研究熱點。與傳統(tǒng)乳酸生產(chǎn)菌相比，凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulans）具有高溫發(fā)酵、己糖/戊糖共利用、糖酸轉(zhuǎn)化率高等特點。該文簡要介紹了乳酸生物煉制過程，分析了技術(shù)難點，重點闡述凝結(jié)芽孢桿菌用于乳酸生物煉制的技術(shù)優(yōu)勢，并指出了目前存在的技術(shù)瓶頸和解決策略，最后對乳酸生物煉制的工業(yè)化應(yīng)用提出了技術(shù)展望。

乳酸；生物煉制；發(fā)酵；凝結(jié)芽孢桿菌

乳酸是一種重要的有機酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。以乳酸為單體合成的聚乳酸被認為是最有前途的生物塑料制品，有望解決石化塑料引發(fā)的“白色污染”環(huán)境問題[1]，乳酸的開發(fā)研究因而得到研究者的持續(xù)關(guān)注。乳酸主要由微生物發(fā)酵獲得，玉米、小麥等淀粉作物是主要的生產(chǎn)原料。乳酸的市場需求量逐年遞增，利用糧食作物生產(chǎn)乳酸不僅生產(chǎn)成本難以降低，而且會出現(xiàn)“與人爭糧，與糧爭地”的窘迫局面，因此開發(fā)新的乳酸生產(chǎn)途徑迫在眉睫。

生物煉制（bio-refinery）是同石油煉制相對應(yīng)的概念，是指以可再生的生物質(zhì)（尤其是木質(zhì)纖維素）為原料生產(chǎn)燃料化學(xué)品和化工材料的新型工業(yè)模式。木質(zhì)纖維素主要包括秸稈、木材、甘蔗渣、木薯渣等工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物，其中秸稈是自然界中蘊含量最為豐富的木質(zhì)纖維素資源，利用秸稈生物煉制生產(chǎn)各種生化產(chǎn)品已成為學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界的研究重點。以秸稈等含木質(zhì)纖維素的農(nóng)業(yè)廢棄物為原料實現(xiàn)乳酸生物煉制，不僅可以降低乳酸生產(chǎn)成本，還可實現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物的轉(zhuǎn)化與利用，是一條實現(xiàn)木質(zhì)纖維素資源綜合利用的新途徑[2]。

1 乳酸生物煉制

秸稈原料結(jié)構(gòu)致密而復(fù)雜，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三種主要組分通過化學(xué)鍵相連，形成復(fù)雜而又致密的物理結(jié)構(gòu)。自然界中，能直接降解木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乳酸的微生物十分罕見。因此，乳酸生物煉制一般需要通過三個步驟（即原料預(yù)處理、纖維素及半纖維素酶解、發(fā)酵水解糖類物質(zhì)）生產(chǎn)乳酸[3]。

1.1 原料預(yù)處理

木質(zhì)纖維素中纖維素分子被木質(zhì)素和半纖維素保護，微生物和纖維素酶無法有效接觸到纖維素分子，嚴重阻礙了纖維素的降解利用[4]，因此原料的預(yù)處理步驟必不可少。預(yù)處理的目的主要是破壞纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的有序結(jié)構(gòu)，在空間上將纖維素分子充分暴露，增大纖維素酶或者微生物的接觸面積，能促進纖維素降解。酸處理法、堿處理法和蒸汽爆破法是最常用的預(yù)處理方法。

木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程不可避免的會產(chǎn)生糠醛、甲酸、香草醛等發(fā)酵抑制物。通常，經(jīng)預(yù)處理后產(chǎn)物都需要經(jīng)過“脫毒”工藝之后再用作發(fā)酵原料。脫毒工藝需要額外的設(shè)備投入、能耗和洗滌用水，增加了發(fā)酵成本。因此，選育抗抑制物菌種，利用原料不脫毒直接發(fā)酵是解決此問題的最佳途徑。

1.2 酶解

秸稈經(jīng)預(yù)處理后，酶解是必不可少的步驟。纖維素酶（半纖維素酶）是一類能降解纖維素（半纖維素）產(chǎn)生葡萄糖等微生物碳源的復(fù)合酶系。以纖維素酶為例，商業(yè)銷售的纖維素酶產(chǎn)品大多產(chǎn)自里氏木霉（Trichodermareesei）。內(nèi)切葡聚糖酶（endo-β-1,4-glucanase）和外切葡聚糖酶（exoβ-1,4-glucanase）以及用于降解纖維二糖（cellobiose）的β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase）是完成纖維素降解的三種主要酶[5]。在纖維素酶解過程中，存在嚴重的產(chǎn)物抑制現(xiàn)象（見圖1）。反應(yīng)體系中存在的葡萄糖具有反饋抑制作用，不利于β-葡萄糖苷酶的催化活力，阻礙纖維二糖的分解。而且，纖維二糖又會對外切葡聚糖酶產(chǎn)生嚴重抑制作用，限制纖維素原料酶解的過程。為了彌補商業(yè)纖維素酶的活力不足，酶解過程通常補加β-葡萄糖苷酶以提高酶解速度。然而，即使在酶解過程中添加β-葡萄糖苷酶，葡萄糖的抑制作用依舊不能完全消除，并且會增加酶解成本。因此，不斷去除酶解產(chǎn)物（葡萄糖和纖維二糖）可從根本上提高酶解效率。

圖1 纖維素酶解過程中的產(chǎn)物抑制示意圖Fig.1 Schematic diagram of product inhibition during cellulose hydrolysis

同步糖化發(fā)酵（simultaneous saccharification and fermentation，SSF）或者同步糖化共發(fā)酵（simultaneous saccharification and co-fermentation，SSCF）是一種解除纖維素酶解反饋抑制的公認方法[6]。同步糖化發(fā)酵是指纖維素酶解過程與微生物發(fā)酵過程耦合，發(fā)酵過程不斷利用酶解產(chǎn)物，促進了酶解反應(yīng)。并且，同步糖化發(fā)酵過程合并了酶解和發(fā)酵過程，節(jié)省反應(yīng)器使用。然而，大部分乳酸生產(chǎn)菌種為中溫菌，應(yīng)用于同步糖化發(fā)酵過程時無法發(fā)揮纖維素酶的最佳催化能力（最佳酶活溫度在50℃左右）。因此，利用高溫乳酸生產(chǎn)菌進行秸稈生物轉(zhuǎn)化十分必要。

1.3 發(fā)酵生產(chǎn)乳酸

秸稈經(jīng)預(yù)處理和酶降解后，得到的是由己糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖等）和戊糖（木糖、阿拉伯糖等）組成的混合糖[7]。大部分報道的乳酸桿菌屬菌種（如Lactobacillusrhamnosus、Lactococcus lactis）雖然可以高效轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)乳酸，但是對戊糖的代謝能力十分有限。實際上，秸稈等木質(zhì)纖維素原料中半纖維素含量僅次于纖維素（見表1），依原料種類不同半纖維素含量范圍為19%～40%。如果將秸稈中半纖維素利用起來進行乳酸發(fā)酵，那么就會極大提高原料利用率，實現(xiàn)秸稈的高值化綜合利用。

表1 不同來源木質(zhì)纖維素組成[8]Table 1 Composition of lignocellulosic from different sources

2 凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于乳酸生物煉制的優(yōu)勢

微生物作為生物煉制的主要參與者，對于生物煉制的整個過程具有重要的意義。從工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用而言，根霉菌（Rhizopus）和乳酸細菌（lactic acid bacteria）是研究最多的乳酸生產(chǎn)菌種[9]。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是1915年由HAMMER等從腐敗的乳制品中分離的一株古老的微生物，由于其可產(chǎn)生凝結(jié)素抑制其他細菌生長而得名，凝結(jié)芽孢桿菌作為益生菌在食品保健領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[10]。然而，直到近10年，隨著生物煉制和白色生物技術(shù)（white biotechnology）的興起，凝結(jié)芽孢桿菌才以工業(yè)微生物的身份得到重新關(guān)注[11]。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸具有營養(yǎng)要求低、木糖高效利用、高溫發(fā)酵、生長快速等優(yōu)勢。

2.1 乳酸發(fā)酵

微生物利用己糖或者戊糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的代謝途徑如圖2所示。通常，以碳源對乳酸的理論得率為標準，將乳酸發(fā)酵過程分為同型發(fā)酵（homolactic fermentation）和異型發(fā)酵（heterolactic fermentation）。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵葡萄糖生產(chǎn)乳酸時，葡萄糖在細胞內(nèi)的同化過程遵循經(jīng)典的葡萄糖酵解途徑（glycolytic pathway），1 mol葡萄糖分子能發(fā)酵生成2 mol乳酸，乳酸理論得率為1.0 g/g，是典型的乳酸同型發(fā)酵[12]。

秸稈經(jīng)預(yù)處理和酶降解后，得到的是由葡萄糖和戊糖（主要為木糖和阿拉伯糖）組成的混合糖。微生物對戊糖的代謝途徑在圖2中也進行了詳細闡述。大部分報道的乳酸桿菌屬菌種（如Lactobacillus rhamnosus、Lactococcus lactis）對戊糖的代謝能力十分有限。能夠利用戊糖的部分乳酸細菌也是通過磷酸己酮醇酶（phosphoketolase，PK）途徑代謝戊糖[13]，戊糖生物轉(zhuǎn)化乳酸效率不高，多有副產(chǎn)物產(chǎn)生，乳酸的理論得率僅為0.6 g/g。凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于乳酸生物煉制的優(yōu)勢在于優(yōu)異的五碳糖利用能力，可實現(xiàn)戊糖的同型乳酸發(fā)酵。凝結(jié)芽孢桿菌是通過戊糖磷酸（pentose phosphate，PP）途徑代謝木糖生產(chǎn)乳酸，乳酸得率理論上可達到1.0 g/g[14]。

圖2 同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵代謝途徑Fig.2 Pathway of homolactic fermentation and heterolactic fermentation

與目前乳酸工業(yè)生產(chǎn)菌種（乳酸桿菌屬細菌）相比，凝結(jié)芽孢桿菌代謝木糖能力強，可實現(xiàn)秸稈水解液中的己糖（葡萄糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖）高效生物轉(zhuǎn)化，可得到更高濃度乳酸產(chǎn)品，更適用于利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乳酸。

2.2 抑制物耐受能力強

糠醛和5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，HMF）木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中戊糖生成的副產(chǎn)物，是木質(zhì)纖維素水解液中最主要的發(fā)酵抑制物。酵母菌和大部分細菌對糠醛和HMF十分敏感，而凝結(jié)芽孢桿菌對上述兩種抑制物具有很好的耐受能力。ZHANG Y等[15]報道的一株凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）IPE22可以耐受質(zhì)量濃度低于3.0 g/L的糠醛和質(zhì)量濃度低于2.0 g/L的HMF。THOMASSER C等[16]研究了另一株凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）MXL-9對糠醛和HMF的耐受能力，在抑制物質(zhì)量濃度超過2.0 g/L時菌體生長也不會受到明顯抑制。木質(zhì)纖維素預(yù)處理產(chǎn)生的乙酸和甲酸也會對微生物的生長產(chǎn)生抑制作用。通常情況下，甲酸對微生物的抑制作用更為明顯[17]。B.coagulansIPE22顯示出了非常優(yōu)秀的乙酸鹽耐受性，培養(yǎng)基中添加30 g/L乙酸鹽未對菌體的生長產(chǎn)生抑制作用，該菌株的甲酸耐受質(zhì)量濃度為1.0 g/L[15]。凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）NL01具有很強的甲酸的耐受性，當(dāng)培養(yǎng)基中存在2.0 g/L甲酸鹽時，對菌種生長不但沒有影響，并且其發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的能力會得到增強[18]。香草醛是在木質(zhì)纖維素預(yù)處理時，木質(zhì)素降解產(chǎn)生的化合物。菌種B.coagulansMXL-9可以耐受2.5 g/L的香草醛[19]，B.coagulansIPE22可以耐受3.0 g/L的香草醛[15]。凝結(jié)芽孢桿菌對多種發(fā)酵抑制物的耐受能力與已有報道的乳酸生產(chǎn)菌相比具有明顯的優(yōu)勢。

2.3 高溫發(fā)酵

米根霉的乳酸發(fā)酵溫度為30～37℃，乳酸菌的發(fā)酵溫度為40～45℃。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵溫度為50～55℃，在此溫度條件下發(fā)酵培養(yǎng)基無需滅菌直接發(fā)酵，雜菌幾乎不能生存，并且發(fā)酵罐等設(shè)備無需滅菌，可實現(xiàn)開放式發(fā)酵模式[20]。因此，發(fā)酵規(guī)?？梢宰龅母螅欣谝?guī)模生產(chǎn)和降低成本，相對其他發(fā)酵方式其設(shè)備投入和維護成本也相應(yīng)較小。值得指出的是，凝結(jié)芽孢桿菌高溫發(fā)酵特性與纖維素酶商業(yè)產(chǎn)品的最佳催化溫度一致，利用凝結(jié)芽孢桿菌進行SSF或SSCF實驗，能實現(xiàn)酶解過程和發(fā)酵過程的最優(yōu)組合。ZHANG Y等[15]使用B.coagulansIPE22高溫（52℃）發(fā)酵小麥秸稈，借助SSF工藝，以10 g/L玉米漿為氮源，發(fā)酵100 g小麥秸稈得到46.12 g乳酸。HU J等[21]詳細研究了B.coagulansLA204的高溫發(fā)酵工藝，以玉米秸稈為底物進行分批補料同步糖化發(fā)酵實驗，獲得了97.59 g/L乳酸。上述研究中，得益于凝結(jié)芽孢桿菌高溫發(fā)酵特點，整個發(fā)酵過程避免了無菌操作，大幅度降低了能耗。因此，凝結(jié)芽孢桿菌的高溫生長特性可實現(xiàn)開放式發(fā)酵操作，技術(shù)經(jīng)濟性優(yōu)勢明顯，并且高溫發(fā)酵使同步糖化工藝得以實施，木質(zhì)纖維素酶解效率顯著提高[22]。

3 凝結(jié)芽孢桿菌應(yīng)用于乳酸生物煉制的瓶頸及對策

3.1 乳酸的產(chǎn)物反饋抑制明顯

乳酸發(fā)酵過程是典型的產(chǎn)物抑制類型，隨著乳酸的不斷產(chǎn)生，發(fā)酵液的pH值不斷降低，菌體細胞逐漸喪失生長和產(chǎn)酸能力。雖然，發(fā)酵過程中添加氨水、氫氧化鈣、氫氧化鈉等堿性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)pH，但是乳酸鹽依舊會抑制生產(chǎn)菌的生長和發(fā)酵能力。與傳統(tǒng)乳酸生產(chǎn)菌相比，凝結(jié)芽孢桿菌的對乳酸產(chǎn)物耐受能力不高[23]，當(dāng)發(fā)酵液中游離乳酸質(zhì)量濃度達到50 g/L后，產(chǎn)物會對菌體生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，導(dǎo)致發(fā)酵停止。

針對凝結(jié)芽孢桿菌的菌種遺傳改造工作得到研究人員的重視。蔡聰?shù)萚24]為了提高菌種發(fā)酵木糖生產(chǎn)L-乳酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，對B.coagulansNL01進行等離子體誘變育種，最終獲得乳酸產(chǎn)量提高21.51%的正向突變株。王芳[25]以秸稈糖為篩選條件，借助紫外誘變技術(shù)獲得一株遺傳性狀穩(wěn)定的乳酸高產(chǎn)菌株（B.coagulans）FYFJ20，乳酸產(chǎn)量提高了約53%。趙春云等[26]針對凝結(jié)芽孢桿菌基因工程改造中存在的外源脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）導(dǎo)入效率不高的問題，采用向培養(yǎng)基中添加高滲劑方法進行電轉(zhuǎn)化，顯著提高了B.coagulansP4-102B的轉(zhuǎn)化穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率，為菌種基因工程操作提供了方法支撐。

為克服或減弱反饋抑制，選育能耐受自身代謝物菌種是提高生產(chǎn)指標的一種選擇。將發(fā)酵與分離過程相結(jié)合的方式即發(fā)酵與分離耦合技術(shù)可以選擇性地從培養(yǎng)液中分離或吸附抑制性產(chǎn)物也可有效消除反饋抑制。發(fā)酵與分離過程耦合還可以簡化下游的分離純化過程、縮短生產(chǎn)周期，從而有利于提高整個生物加工過程的生產(chǎn)效率。文獻報道[27]，借助膜耦合重復(fù)批次發(fā)酵技術(shù)，實現(xiàn)B.coagulansIPE22細胞循環(huán)發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物乳酸不斷被分離出發(fā)酵體系，有效解除了產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象，乳酸產(chǎn)率顯著提高。

3.2 己糖/戊糖同步利用問題

乳酸生物煉制的發(fā)酵底物為木質(zhì)纖維素水解液，含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖等己糖/戊糖混合糖。凝結(jié)芽孢桿菌利用混合糖發(fā)酵時，也存在一個技術(shù)難題：菌體會優(yōu)先利用葡萄糖，待其消耗完畢后，經(jīng)過相當(dāng)一段時間延滯后，再利用木糖繼續(xù)發(fā)酵，出現(xiàn)所謂的二次生長（或二次發(fā)酵）現(xiàn)象[28]。這是因為大部分微生物選擇優(yōu)先利用葡萄糖作為碳源，并且葡萄糖分解代謝物對其他碳源利用相關(guān)相關(guān)基因的表達產(chǎn)生阻遏。微生物這種優(yōu)先利用葡萄糖，再依次利用其他碳源的現(xiàn)象，稱為碳源代謝阻遏（carbon catabolite repression，CCR）[29]效應(yīng)。凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵混合糖時存在的CCR效應(yīng)會導(dǎo)致木糖等戊糖利用延滯明顯，發(fā)酵時間延長、乳酸生產(chǎn)強度（productivity）受限。針對生物煉制過程中CCR效應(yīng)的研究工作有很多報道，涉及菌種遺傳改造和發(fā)酵策略設(shè)計。中科院上海植生所楊晟課題組針對一株丁醇產(chǎn)生菌，丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum），混合糖發(fā)酵的CCR效應(yīng)進行詳盡研究[30]，分析木糖代謝途徑的關(guān)鍵酶基因、轉(zhuǎn)運基因和調(diào)控基因，并嘗試通過代謝工程手段解除該菌的CCR效應(yīng)[21-22]。值得指出的是，ABDELRAHMAN M等[31]研究了一株蒙氏腸球菌（Enterococcus mundtii）QU25利用混合糖（葡萄糖和木糖）發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過程，發(fā)現(xiàn)控制混合糖中葡萄糖濃度和混合糖比例可以消除CCR效應(yīng)。然而，針對凝結(jié)芽孢桿菌中CCR效應(yīng)研究國內(nèi)外尚無報道，今后應(yīng)加強該菌株的己糖/戊糖利用機制研究，提高混合糖發(fā)酵效率。

4 展望

乳酸是一種多用途的綠色平臺化合物，利用木質(zhì)纖維素資源生物煉制乳酸已成為研究熱點。凝結(jié)芽孢桿菌具有高溫發(fā)酵、生長速度快、產(chǎn)物（L-乳酸）光學(xué)純度高等優(yōu)點，是公認的乳酸生物煉制優(yōu)良菌種。盡管凝結(jié)芽孢桿菌利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)乳酸具有巨大的優(yōu)勢，但乳酸生物煉制還處于實驗室研發(fā)階段，工業(yè)化進程中還存在生產(chǎn)成本偏高、產(chǎn)品分離純化困難等問題。針對于以上問題，國內(nèi)外研究人員圍繞乳酸生物煉制過程中的關(guān)鍵技術(shù)進行了深入研究[32]。近期，利用秸稈生物煉制乙醇集成工藝得到成功應(yīng)用[33]。集成工藝，即整合原料預(yù)處理、半纖維素發(fā)酵和纖維素酶解過程，原料預(yù)處理后無需固液分離和脫毒工藝直接進行發(fā)酵。集成發(fā)酵工藝極大的簡化了秸稈的利用過程，可以顯著降低生產(chǎn)成本。實際上，凝結(jié)芽孢桿菌具有抑制物耐受力強、高溫發(fā)酵、己糖/戊糖共利用等特點，乳酸生物煉制過程也可借鑒上述集成工藝策略。此外，乳酸生物煉制得到的發(fā)酵液色素含量高、雜質(zhì)成分復(fù)雜。沿用傳統(tǒng)的乳酸提取“鈣鹽法”[34]很難達到理想的分離純化效果。采用基于超濾-納濾或超濾-反滲透技術(shù)的膜分離提取方法有望解決復(fù)雜料液體系的乳酸分離提取問題[35]。我們相信，深入研究凝結(jié)芽孢桿菌的代謝調(diào)控機制、優(yōu)化乳酸生物煉制工藝策略，致力于降低成本，一定能夠?qū)崿F(xiàn)乳酸生物煉制的工業(yè)化應(yīng)用。

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Application ofBacillus coagulanson lactic acid bio-refinery

ZHANG Yuming
(College of Life Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Lactic acid is an important organic acid and its production from lignocellulose by bio-refinery has attracted much attention.Compared with traditional lactic acid producing strains,Bacillus coagulanscould produce lactic acid at high temperature,co-utilize hexose and pentose,and with high sugar acid conversion rate.In this paper,the lactic acid bio-refinery process was briefly introduced,and the key technological difficulties during the process were systematically discussed.Advantages ofB.coagulansapplication in lactic acid bio-refinery were elucidated extensively,and the bottleneck and solution strategy was also discussed.At last,the industrial application of lactic acid bio-refinery was proposed as well.

lactic acid;bio-refinery;fermentation;Bacillus coagulans

TS201.1

0254-5071（2017）02-0010-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.02.003

2016-09-16

河北省科技廳科技計劃項目（15222912）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目（QN2015174）；河北大學(xué)中西部提升綜合實力專項資金資助項目

張玉明（1979-），男，副教授，博士，研究方向為應(yīng)用生物化學(xué)。