（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

上海株犬冠狀病毒的分離鑒定及S基因的遺傳進(jìn)化分析

沈美艷，孫秋艷，李 舫，王彩霞

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061）

利用A72細(xì)胞（犬纖維肉瘤細(xì)胞系）從上海市某寵物醫(yī)院臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎癥狀的幼犬腹瀉糞便中分離到1株病毒，通過噬斑純化、病毒理化特性檢測(cè)以及動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)和RT-PCR鑒定，證明所分離到的病毒為犬冠狀病毒（Canine coronavirus，CCV），將其命名為CCV-SHdc株。根據(jù)GenBank公布的CCV S基因序列，設(shè)計(jì)合成4對(duì)特異性引物，利用RT-PCR成功擴(kuò)增獲得CCV-SHdc株S基因序列，同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定和核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹繪制。結(jié)果顯示，CCV-SHdc株的S基因序列全長(zhǎng)4 364 bp；該毒株與日本分離的CCV 5821株親緣關(guān)系最近，處于同一分支，與意大利分離的CCV 23/03和CCV Elmo/02株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。核苷酸與氨基酸同源性分析表明，CCV-SHdc株與CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能屬于不同基因型，已有很多點(diǎn)發(fā)生突變，這種突變的累積有可能引起病毒毒力的變化。

犬冠狀病毒；分離鑒定；S基因；RT-PCR；遺傳進(jìn)化分析

犬冠狀病毒（Canine coroanvires，CCV）是引起犬冠狀病毒病的主要病原[1]，1971年由Binn等[2]首次從腹瀉的德國(guó)軍犬中分離到，之后世界各地相繼有報(bào)道[3-5]。CCV可感染不同年齡、性別、品種的犬，但以幼犬發(fā)病率最高，狼、大熊貓等其它動(dòng)物也有易感性[6-8]。CCV主要引起犬的急性胃腸炎，臨床上表現(xiàn)為頻繁嘔吐、腹瀉、沉郁、厭食，發(fā)病率和死亡率均較高。該病毒既能單獨(dú)致病，也能與其他病原發(fā)生混合感染，是當(dāng)前對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)危害較大的病原。CCV具有高傳染性，其分離鑒定和早期確診對(duì)該病的預(yù)防控制具有重要意義。

CCV是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，基因組編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白。其中，纖突蛋白（S）位于病毒最外層，具有嚴(yán)格的細(xì)胞感染特異性。S蛋白的N端與宿主細(xì)胞表面的受體結(jié)合，可使病毒與細(xì)胞膜靠近，并參與膜融合。這在病毒侵染細(xì)胞的過程中起著至關(guān)重要的作用。S蛋白含有的抗原表位是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要保護(hù)性抗原。S蛋白的C端參與病毒粒子的裝配及蛋白的胞內(nèi)運(yùn)輸，并在一定程度上決定病毒的致病性，是CCV致病作用的主要成分。因此研究S基因有利于了解冠狀病毒的基因重組、抗原變異、病毒感染細(xì)胞機(jī)制和基因變化規(guī)律。

本研究從上海市某寵物醫(yī)院臨床表現(xiàn)為急性胃腸炎癥狀的3月齡幼犬腹瀉糞便中，通過細(xì)胞分離培養(yǎng)，成功分離到1株病毒，并通過病毒理化特性檢測(cè)、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)和RT-PCR鑒定，確診分離的病毒株為CCV。為研究該毒株與其他CCV的親緣關(guān)系，對(duì)分離毒株的S基因進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)分離毒株的遺傳進(jìn)化進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞及毒株

A72細(xì)胞（犬纖維肉瘤細(xì)胞系）、MDCK細(xì)胞及參考毒株CCV 1-71株，由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

病毒RNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技有限公司；AMV第一鏈cDNA合成試劑盒，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒分離

將采集的糞便用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液1:4稀釋，9 000 r/min 離心30 min；用0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液，將其接種于長(zhǎng)滿單層的A72細(xì)胞和MDCK細(xì)胞；將不出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）的病毒連續(xù)傳7代，如仍不出現(xiàn)CPE則視為陰性；如有CPE，就繼續(xù)傳代，直到CPE穩(wěn)定；然后進(jìn)行噬斑試驗(yàn)，純化病毒。

1.4 噬斑試驗(yàn)

[9]中的方法進(jìn)行。

1.5 病毒理化特性試驗(yàn)

1.5.1 病毒核酸類型的鑒定。用5-BUDR（5-溴脫氧尿核苷）法進(jìn)行鑒定[10]。

1.5.2 病毒抵抗力的鑒定。將分離的病毒相應(yīng)處理后，接種A72細(xì)胞，進(jìn)行耐乙醚、耐氯仿、耐胰酶、耐酸、耐熱等試驗(yàn)[10]。

1.6 病毒TCID50的測(cè)定

按Reed-Muench法測(cè)定病毒的TCID50。

1.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

取5只3月齡SPF幼犬，隨機(jī)分成2組（試驗(yàn)組3只、對(duì)照組2只）。將CCV-SHdc經(jīng)口接種試驗(yàn)組幼犬，劑量為10 000 TCID50/只；對(duì)照組用同樣的方法和劑量接種無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)液。觀察病毒對(duì)幼犬的致病性，同時(shí)進(jìn)行病原分離。

1.8 RT-PCR的鑒定

1.8.1 引 物 合 成。 參 照GenBank編 號(hào) 為AY796289.1的CCV S基因的核苷酸序列，設(shè) 計(jì)1對(duì)特 異 性 引 物，Primer（Forward）：5'GCAACTAGTTCTGATTTTGTTC 3'；Primer（Reverse）：5'GCGTTAATTAACCTGCAGGGGCTGTGA 3'，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.8.2 RNA的提取。將參考株CCV 1-71、處理后的糞便上清液、第11代細(xì)胞培養(yǎng)物、純化病毒和動(dòng)物回歸試驗(yàn)中的腸道病料，按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取RNA。參考株CCV 1-71作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.8.3 cDNA的合成。按照AMV第一鏈cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA。

1.8.4 PCR反應(yīng)。按參考文獻(xiàn)[9]中的方法進(jìn)行。

1.9 CCV-SHdc株S基因遺傳進(jìn)化分析

1.9.1 引物合成。參照GenBank中CCV S基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.9.2 RT-PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)方法同1.8。

1.9.3 目的片段回收及測(cè)序。用天根公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠回收試劑盒，分別回收純化病毒的PCR產(chǎn)物，送往上海杰李生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 CCV S基因的引物設(shè)計(jì)

1.9.4 S基因序列分析。將得到的4個(gè)S基因片段拼接成完整的S基因序列，應(yīng)用DNAStar軟件，將拼接完整的S基因序列與GenBank中登錄的9株CCV毒株的完整S基因序列，進(jìn)行同源性比較，并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 CCV分離培養(yǎng)

將處理好的病毒液分別接種A72細(xì)胞、MDCK細(xì)胞，盲傳至第7代，24 h后觀察到明顯的CPE；48 h后，85%的單層細(xì)胞脫落，對(duì)照細(xì)胞正常。MDCK細(xì)胞在盲傳第7代后仍無(wú)病毒生長(zhǎng)。

2.2 噬斑試驗(yàn)

CCV-SHdc株在A72細(xì)胞上形成的噬斑同參考毒株CCV 1-71形成蝕斑特征相同，蝕斑形態(tài)均一，直徑在5 mm左右，外形圓而規(guī)則（圖1）。

圖1 CCV 1-71和CCV-SHdc株在A72細(xì)胞上形成的噬斑

2.3 病毒理化特性試驗(yàn)

2.3.1 病毒核酸類型。試驗(yàn)組的TCID50為10-5.41/0.1 mL，對(duì)照組的TCID50為10-5.57/0.1 mL，二者的TCID50的對(duì)數(shù)差值小于1，表明5-BUDR不能抑制該病毒的增殖，證明該毒株的核酸類型為RNA。

2.3.2 病毒抵抗力。病毒抵抗力的試驗(yàn)結(jié)果表明，分離的病毒株均耐酸、耐胰酶，對(duì)乙醚、氯仿、熱較敏感，符合RNA病毒的特性。

2.4 病毒TCID50的測(cè)定CCV-SHdc第11代培養(yǎng)物的TCID50為10-5.57/0.1 mL。

2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

在接種28 h后，試驗(yàn)組幼犬出現(xiàn)精神沉郁、厭食、嘔吐、腹瀉；接種48 h后，腹瀉加重，糞便呈灰白或淡黃色，并帶有腥臭氣味，體重下降，脫水；第7天，實(shí)驗(yàn)組幼犬死亡1只，剖檢發(fā)現(xiàn)腸管擴(kuò)張變薄，充滿液體，小腸壁變薄，腸黏膜充血、出血，腸系膜淋巴結(jié)腫大；第10 天，犬全部死亡，說明分離病毒株的毒力較強(qiáng)。應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)試驗(yàn)組糞便處理液，結(jié)果CCV均為陽(yáng)性，對(duì)照組為陰性。

2.6 RT-PCR的鑒定

CCV-SHdc毒株病料處理液、純化病毒、第11代細(xì)胞培養(yǎng)物和動(dòng)物回歸試驗(yàn)中的腸道病料均能擴(kuò)增出與參考株CCV 1-71相同的553 bp目的片段（圖2），從而確定該株病毒為CCV。對(duì)照組的犬腸道病料擴(kuò)增結(jié)果為陰性。

圖2 RT-PCR鑒定結(jié)果

2.7 S基因遺傳進(jìn)化分析

2.7.1 遺傳進(jìn)化分析。將CCV-SHdc株S基因序列與GeneBank中登錄的9株CCV毒株（基因登錄號(hào)分別為CCV1-71：AY 796289.1；CCV-V1：AY390342.1；K378：X77047.1；23/03：AY307021.1；Elmo/02：AY307020.1；5821：AB017789.1；CCV-6：A22882.1；V54：A22886.1；GP：AY436637.1）的相應(yīng)完整S基因序列，繪制核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果顯示，CCV-SHdc株與日本分離的CCV 5821株親緣關(guān)系最近，處于同一分支，與意大利分離的CCV 23/03和CCV Elmo/02株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 CCV-SHdc分離株S基因進(jìn)化樹分析

2.7.2 核苷酸與氨基酸同源性分析。CCV-SHdc株 與 23/03、5821、Elmo、GP、K378、V54、1-71、CCV-6和CCV-V1株的核苷酸序列同源性分別為38.3%、99.5%、36.4%、90.6%、90.4%、76.6%、90.7%、49.8%和90.6%，氨基酸序列同源性分別為43.7%、98.5%、44.2%、91.9%、91.7%、4.2%、92.3%、6.3%和92.1%（表2）。

表2 CCV-SHdc株與CCV毒株S基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比較

3 討論

CCV通過其表面纖突和易感細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合可侵入易感細(xì)胞。由于CCV纖突較大，在理化因素的作用下極易脫落，所以本實(shí)驗(yàn)在對(duì)采集的糞便病料進(jìn)行初步處理時(shí)，采用了含10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行稀釋，這樣可以提高分離CCV的成功率。Binn等[11]在首次從腹瀉的軍犬糞便中成功分離到CCV的過程中，采用犬腎原代細(xì)胞，并向培養(yǎng)液中添加多聚葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分。Keenan等[12]采用同樣方法分離獲得成功。Binn等[13]建立了對(duì)CCV極為敏感的犬纖維瘤傳代細(xì)胞系，即A72細(xì)胞；Carmichael等[13]采用該細(xì)胞系相繼分離到CCV。

CCV在適應(yīng)細(xì)胞之前，培養(yǎng)很不穩(wěn)定，也不易產(chǎn)生細(xì)胞病變。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了最為敏感的傳代細(xì)胞系A(chǔ)72細(xì)胞來(lái)分離CCV，而且盡可能的盲傳多代，直到CPE穩(wěn)定后，才對(duì)病毒進(jìn)行其它鑒定。初次分離的CCV在MDCK細(xì)胞上很難生長(zhǎng)，所以A72細(xì)胞是分離CCV病毒的最適生長(zhǎng)細(xì)胞，可對(duì)分離到的病毒株做出初步鑒定。由于糞便中病毒種類較雜，TGEV（豬傳染性胃腸炎病毒）、FCV（貓冠狀病毒）等也能在A72細(xì)胞上生長(zhǎng)，所以本實(shí)驗(yàn)采用噬斑克隆進(jìn)行病毒純化。不同病毒在同種細(xì)胞上形成的蝕斑特征不一樣，同一種病毒在同一種細(xì)胞上形成蝕斑特性一般比較穩(wěn)定，因此根據(jù)分離株與CCV參考株相同的噬斑特征，可以提高病毒的檢出率。

由于糞便中常存在類似CCV的病毒粒子，因此電鏡檢查的結(jié)果并不理想，所以本實(shí)驗(yàn)沒有采用電鏡，而是通過病毒理化特性進(jìn)行病毒的形態(tài)學(xué)鑒定，證實(shí)該病毒是一種有囊膜、對(duì)熱比較敏感的RNA病毒，符合CCV理化特性。為了深入研究分離病毒的致病性，采用動(dòng)物回歸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攻毒組動(dòng)物出現(xiàn)特征性的CCV臨床癥狀和病理剖檢變化，由此證實(shí)分離毒株對(duì)犬有致病性，為深入開展該病毒的致病機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)最后采用RT-PCR方法鑒定分離毒株，排除了細(xì)小病毒感染的可能，結(jié)合序列測(cè)定和分析，確證分離的病毒為CCV。

核苷酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明，CCV-SHdc株與意大利分離的CCV 23/03和CCV Elmo/02株親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，核苷酸同源性為38.3%和36.4%，氨基酸的同源性為43.7%和44.2%；與5821、GP、K378、1-71和CCV-V1株核苷酸同源性在90.4%～99.5%之間，氨基酸的同源性在91.7%～98.5%之 間。CCV 23/03和CCV Elmo/02株與其他毒株核苷酸同源性分別在36.5%～38.3%和35.8%～38.3%之間，氨基酸的同源性分別在4.5%～44.6%和4.2%～44.4%之間，因此CCV 23/03和CCV Elmo/02株在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹上處于獨(dú)立同一分支。由此說明CCV-SHdc株與CCV 23/03和CCV Elmo/02株可能屬于不同的基因型，CCV 23/03和CCV Elmo/02株屬于同一基因型。目前CCV仍只有1個(gè)基因型，但也曾有新基因型CCVⅠ型存在的報(bào)道。CCV-SHdc株與荷蘭分離的CCV-6和CCV-V54株核苷酸同源性分別為76.6%和49.8%，氨基酸的同源性分別為4.2%和6.3%，由此說明CCV-SHdc株S基因已有多點(diǎn)發(fā)生突變。CCV-6和CCV-V54株都是強(qiáng)毒株，這種突變的累積有可能引起病毒毒力的變化[14]。這個(gè)問題有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]張伯強(qiáng)，陸承平，陳懷清. ELISA法檢測(cè)犬腹瀉糞樣中的犬冠狀病毒[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1997，17 （5）：437-439.

[2]BINN L N，LAZAR E C，KEENAN K P，et al. Recovery and characterization of a coronavirus from military dogs with diarrhea [J]. Proc Annu Meet US Anim Health Assoc，1974，78：359-366.

[3]TENNANT B J，GASKELL R M，JONES R C，et al. Studies on the epizootiology of canine coronavirus[J].Vet Rec，1993，132：7-11.

[4] PRATELLI A，BUONAVOGLIA D，MARTELLA V，et al. Diagnosis of canine coronavirus infection using nested-PCR[J]. J Virol Meth，2000，84：91-94.

[5]MOCHIZUKI M，SUGIURA R，AKUZAWA M. Microneutralization test with canine coronavirus for detection of coronavirus antibodies in dogs and cats[J]. Jpn J Vet Sci，1987，49：563-565.

[6] WOODS R D，WESLEY R D. Immune response in sows given transmissible gastroenteritis or canine coronavirus[J]. Am J Vet Res，1986，47（6）：1239-1242.

[7]何愛華，杜勝芳，林桂華，等. 首次從腹瀉熊貓糞便中檢出冠狀病毒簡(jiǎn)報(bào)[J]. 中國(guó)人獸共患病雜志，1998，4（3）：4-7.

[8]MAINKA S A，QIU X，HE T，et al. Serologic survey of giant pandas（Ailuropoda melanoleuca） and domestic dogs and cats in the WolongReserve China[J]. Journal Wild Disease，1994，30（1）：86-89.

[9]孫秋艷，郭紅梅，沈美艷，等. 豬傳染性胃腸炎病毒的分離鑒定及S基因進(jìn)化分析[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2015，36（7）：7-12.

[10] 殷震，劉景. 動(dòng)物病毒學(xué)[M]. 2版. 北京：北京科學(xué)出版社，1997.

[11]BINN L N，LAZAR E C，KEENAN K P，et al. Recovery and characterization of coronavirus from military dogs with diarrhea[J].Proceeding of the Annual Meeting of the us Animal Health Association，1974，78：359-366.

[12] KEENAN K P，JERVIS H R，MARCHWICKI R H，et al. Intestinal infection of neonatal dogs with canine coronavirus 1-71：studies by virologic，histochemical and immuno fl uorescent techniques[J].Vet Res，1976，3：274-276.

[13] BINN L N，MARCHWICKI R H，STEPHEHON E H. Establishment of canine cell line：Derivation characterization，and viral spectrum[J].Vet Res，1980，41：855-860.

[14]陳安莉，謝芝勛，劉家波，等. 7株廣西鴨源NDV分離株全基因序列測(cè)定及遺傳進(jìn)化分析[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，33（9）：1323-1328.

（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Isolation and Identi fi cation of Canine Coronavirus Shanghai Strain and Phylogenetic Analysis of S Gene

Shen Meiyan，Sun Qiuyan，Li Fang，Wang Caixia
（Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang，Shandong 261061）

A strain of virus was isolated by A72 cells from feces of a diarrhea puppy with clinical manifestation of acute gastroenteritis in a pet clinic in Shanghai city. Through identi fi cation experiments containing plaque puri fi cation，detection of physicochemical properties，animal regression test，and RT-PCR method，the virus strain was con fi rmed as canine coronavirus（CCV）and named CCV-SHdc. Based on the sequence of S gene of CCV published in GenBank，4 pairs of primers were designed to ampli fi ed S gene by RT-PCR. Then sequencing the ampli fi ed gene and drawing a phylogenetic tree. Results indicated that the length of S gene of CCV-SHdc was 4 364 bp. It was closest to strain CCV 5821 that isolated from Japan，belonging to the same one clade，however，it has a farther relationship with CCV 23/03 and CCV Elmo/02 of Italy strain. Analysis of amino acid homology and nucleotide sequence homology indicated genotype of CCV-SHdc strain may be different from strains of CCV 23/03 and CCV Elmo/02. CCV-SHdc strain had multipoint mutation，the accumulation of which would lead to virulence change

canine coronavirus；isolation and identi fi cation；S gene；RT-PCR；phylogenetic analysis

S852.65

B

1005-944X（2017）03-0097-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.03.025

山東省濰坊市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃（2015GX054）

李 舫