黃 赟， 董艷軍， 肖 雁， 官志忠

氧糖剝奪再灌注引起的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡與NF-κBp65和COX-2蛋白表達(dá)的關(guān)系

黃 赟1， 董艷軍2， 肖 雁1， 官志忠1

目的 探討氧糖剝奪再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡情況及NF-κB信號(hào)通路NF-κBp65、COX-2蛋白的表達(dá)。方法 將SH-SY5Y細(xì)胞分為正常對(duì)照組、氧糖剝奪4 h/再灌注24 h組(OGD/R)組。利用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率，蛋白印記法(Western blot)檢測(cè)p65和COX-2的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞凋亡率明顯增高(P<0.05)，p65和COX-2的蛋白表達(dá)也明顯增高(P<0.05)。結(jié)論 氧糖剝奪4 h/再灌注24 h能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過NF-κBp65對(duì)COX-2調(diào)控的信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

氧糖剝奪再灌注； 細(xì)胞凋亡； NF-κBp6； COX-2

缺血是引起細(xì)胞死亡的一個(gè)重要原因，然而醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，真正造成細(xì)胞死亡的原因并不是缺血本身，而是恢復(fù)血供后，過量的自由基對(duì)缺血細(xì)胞的攻擊造成的損傷，這種損傷叫做“缺血再灌注損傷”。而缺血再灌注損傷引起的細(xì)胞凋亡則是造成細(xì)胞死亡的一個(gè)重要原因[1]。眾多研究表明，缺血再灌注后細(xì)胞凋亡率明顯增高[2,3]。然而細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制及其涉及到的信號(hào)通路尚不十分明確。本研究以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y)為研究對(duì)象，通過構(gòu)建氧糖剝奪再灌注模型，模擬缺血再灌注損傷，對(duì)缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及可能機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材 料 細(xì)胞SH-SY5Y細(xì)胞株，為本實(shí)驗(yàn)室本課題組穩(wěn)定保存。試劑:DMEM高糖培養(yǎng)基、雙抗(青霉素、鏈霉素)、0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海貝博生物；p65抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司；COX-2抗體購(gòu)自美國(guó)Gentex公司；GAPDH購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的抗鼠二抗、抗兔二抗均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；蛋白定量試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、顯影定影試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；PVDF膜、ECL-Plus發(fā)光試劑購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；成像膠片購(gòu)自柯達(dá)公司。儀器:流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司；ELX800UV酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tec公司；Western blot跑膠裝置，北京百晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng) 采用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法復(fù)蘇SH-SY5Y細(xì)胞，然后用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至一定密度后置于37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約2～3 d傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 SH-SY5Y細(xì)胞氧糖剝奪模型的建立 實(shí)驗(yàn)前1 d向三氣培養(yǎng)箱內(nèi)充入94%N2+5%CO2混合氣體，使培養(yǎng)箱內(nèi)氣體濃度為94%N2、%CO2、1%O2。將細(xì)胞按0.5×106個(gè)/ml的密度接種于6孔板。24 h后，觀察細(xì)胞已貼壁且生長(zhǎng)良好，將細(xì)胞分為正常對(duì)照組和OGD/R組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組于普通培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；而OGD/R組則將細(xì)胞取出，倒掉原培養(yǎng)基，用PBS清洗3次(1 min/次)以除去原培養(yǎng)基中的葡萄糖和胎牛血清對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響。然后加入只含1%雙抗，不含血清的無(wú)糖培養(yǎng)基，最后將細(xì)胞置于三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。之后取出細(xì)胞，再以PBS清洗3次(1 min/次)后更換含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于普通二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 OGD/R結(jié)束后，收集兩組細(xì)胞。用0.25%不含EDTA的胰酶消化后終止消化，用PBS清洗兩次，每次以1000 rpm/min的速度離心5 min。然后用400 μl 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細(xì)胞。在細(xì)胞懸浮液中加2.5 μl Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于4 ℃冰箱孵育15 min。之后再加入10 μl PI染色液后輕輕混勻于4 ℃冰箱孵育5 min。立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Western blot檢測(cè)p65和COX-2的蛋白表達(dá) RIPA蛋白裂解液與PMSF按100∶1的比例混合后，每孔加入100 μl蛋白裂解液，將細(xì)胞于冰上裂解1 h。之后于4 ℃低溫離心機(jī)12000 r/min離心20 min，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量后以25 μg的蛋白總量上樣。制備8%-聚丙烯酰胺凝膠，以80 V電壓跑至蛋白Marker條帶分開后，將電壓調(diào)至120 V至電泳結(jié)束。然后以200 mA的電流轉(zhuǎn)膜100 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用TBST洗膜兩次，5 min/次，之后封閉液封閉2 h。封閉結(jié)束后TBST洗膜3次，5 min/次，最后一抗p65(1∶1000)、COX-2(1∶1000)、GAPDH(1∶20000)孵育于4 ℃冰箱過夜。第2天回收一抗，TBST洗膜5次，5 min/次，p65和COX-2蛋白以抗兔二抗(1∶10000)孵育1 h，GAPDH蛋白以抗鼠二抗(1∶100000)孵育1 h，TBST洗膜1 h，最后暗室曝光，掃描條帶后使用Image J軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞凋亡情況用凋亡率表示，為早期凋亡與晚期凋亡之和。在流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為FITC-/PI-；右上象限為晚期凋亡細(xì)胞，為FITC+/PI+；而右下象限為早期凋亡細(xì)胞，F(xiàn)ITC+/PI-(見圖1)。從圖上看出，對(duì)照組細(xì)胞主要分布在左下象限，只有少量細(xì)胞分布在右上象限和右下象限；而OGD/R組細(xì)胞在右上象限和右下象限都有明顯增加，說明早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡和壞死細(xì)胞增加。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，OGD/R組與正常對(duì)照組相比細(xì)胞凋亡率明顯增加且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖2)。

2.2 NF-κBp65與COX-2蛋白表達(dá)情況 Western blot結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，OGD/R組p65和COX-2蛋白表達(dá)量均有顯著增高且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖3)。

a:正常對(duì)照組(Control組)；b:氧糖剝奪再灌注組(OGD/R組)

圖1 AnnexinV-FITC /PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡

與Control組比較*P<0.05

與Control組比較*P<0.05

3 討 論

缺血再灌注造成的腦損傷是導(dǎo)致死亡和長(zhǎng)期殘疾的一個(gè)主要因素[4]，在體外研究中，OGD/R模型是體外模擬腦缺血再灌注的常用模型。SH-SY5Y細(xì)胞株是人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有神經(jīng)細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)，因而廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究。細(xì)胞凋亡(apoptosis)或程序化細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程[5]。凋亡過程中細(xì)胞發(fā)生一系列形態(tài)學(xué)及生物化學(xué)的改變，目前在體內(nèi)體外均有多種方法可以檢測(cè)這些改變以反映凋亡過程，如形態(tài)學(xué)檢測(cè)法、DNA片段化檢測(cè)、TUNEL檢測(cè)法等；流式細(xì)胞術(shù)、線粒體膜電位檢測(cè)等[6]。

本實(shí)驗(yàn)研究以SH-SY5Y細(xì)胞為研究對(duì)象構(gòu)建OGD/R模型，以AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)為檢測(cè)手段檢測(cè)細(xì)胞凋亡。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看到，正常對(duì)照組細(xì)胞只有少量細(xì)胞凋亡。當(dāng)OGD/R發(fā)生時(shí)，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，表明SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率明顯增高，說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行OGD/R處理后可明顯誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞凋亡。

核因子-κB(NF-κB)是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，其典型代表是p50/p65異源二聚體，NF-κBp65在缺血引起的程序性細(xì)胞死亡包括細(xì)胞凋亡和自噬中起重要作用[7～9]。Zhang等在研究短暫性腦缺血發(fā)作的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，NF-κBp65激活與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，且抑制NF-κBp65活化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有保護(hù)作用[10]。COX-2為誘生型環(huán)氧化酶，是炎性反應(yīng)的標(biāo)志物，也是腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的關(guān)鍵酶[11]。它是NF-κB信號(hào)通路中一種重要的蛋白分子，對(duì)腦缺血損傷有重要作用，也對(duì)激活NF-κB有重要意義[12]。有報(bào)道指出，當(dāng)缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，大鼠腦組織中COX-2表達(dá)增加[13]。本課題組前期研究表明，缺血再灌注大鼠海馬NF-κBp65及COX-2的表達(dá)均高于正常SD大鼠[14]。本次研究利用Western blot技術(shù)對(duì)NF-κBp65和COX-2在SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)OGD/R后，細(xì)胞NF-κBp65和COX-2的表達(dá)量較正常對(duì)照組都有明顯增高。說明當(dāng)OGD/R發(fā)生時(shí)可能激活了NF-κB信號(hào)通路，NF-κBp65又對(duì)其下游的COX-2產(chǎn)生作用，使其表達(dá)量增高。

綜上所述，當(dāng)對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪4 h、再灌注24 h處理后，細(xì)胞凋亡率較正常細(xì)胞明顯上升，且NF-κB信號(hào)通路被激活，說明其產(chǎn)生凋亡的機(jī)制可能是通過NF-κBp65激活COX-2實(shí)現(xiàn)的。

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The relationship between the apoptosis of SH-SY5Y cells and NF-κBp65,COX-2 after oxygen-glucose deprivation/reperfusion

HUANGYun,DONGYanjun,XIAOYan,etal.

(TheKeyLaboratoryofMolecularBiology,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,China)

Objective To explore the relationship between the apoptosis of SH-SY5Y cells and NF-κBp65,COX-2 after oxygen-glucose deprivation/reperfusion (OGD/R).Methods Cells were divided into normal control group and oxygen glucose deprivation 4 h/reperfusion 24 h groups.The cell apoptosis rate was analyzed using flowcytometry,and Western blot assay was used to evaluate the expression of p65 and COX-2 proteins in control group and OGD/R group.Results Compared with the normal control group,the apoptosis rate of OGD/R group was significantly higher (P<0.05),and the protein expression of p65 and COX-2 was also significantly increased (P<0.05).Conclusion Oxygen glucose deprivation 4 h/reperfusion 24 h can induced apoptosis,which may be through the signaling pathway that NF-κB p65 regulates COX-2 to achieve.

Oxygen-glucose deprivation/reperfusion; Apoptosis; NF-κBp65; COX-2

2016-10-09；

2016-11-29

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81160149)；貴州省科技廳基金項(xiàng)目[黔科合J字(2014)2012]

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2.貴州省人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽(yáng) 550004)

肖 雁，E-mail：xiaoyanhonan@hotmail.com

1003-2754(2017)02-0119-03

R743.3

A