鄭林祿，陳 敏，魏 芬，阮俊峰，韓 瑩，王雙花

[1.寧德師范學(xué)院 化學(xué)系，福建 寧德 352100；2.福建省特色生物化工材料重點(diǎn)實驗室，福建 寧德 352100；3.福建省生態(tài)產(chǎn)業(yè)綠色技術(shù)重點(diǎn)實驗室(武夷學(xué)院)，福建 南平 354300；4.寧德師范學(xué)院 生物系，福建 寧德 352100]

仙人掌皂苷是仙人掌中含治療功效成分中的一種重要生物活性成分，主要以齊墩果酸型三萜類皂苷為主，具有降血糖、抗腫瘤、抗氧化和消炎止痛等獨(dú)特生理功能[1-4]。將其配制成藥內(nèi)服，可達(dá)到祛痰、止咳、平喘的功效。此外，通過對三萜皂苷的結(jié)構(gòu)和藥理分析顯示其還具有提高機(jī)體免疫能力、強(qiáng)心活血、提高應(yīng)激能力和機(jī)體興奮性的功效[5-7]。

對于仙人掌總皂苷的提取，研究者們一直在不斷探索研究中。韓本勇等人[8-9]采用有機(jī)溶劑法從仙人掌中提取皂苷化合物。有機(jī)溶劑提取法主要存在的問題是采用的多數(shù)有機(jī)溶劑有毒、易揮發(fā)，而微波處理和超聲波提取無形中又增加成本，大孔吸附樹脂法濃縮時可能導(dǎo)致部分皂苷析出損失。近年來研究者發(fā)現(xiàn)酶解法可降低能耗，縮短提取時間，提高目標(biāo)物質(zhì)的提取率，且避免了揮發(fā)性有機(jī)物的使用，安全環(huán)保[10-15]。基于果膠酶可以發(fā)生酶解反應(yīng)快速除去果膠物質(zhì)，有效地破壞植物的細(xì)胞壁，能夠更方便快捷的使皂苷溶解出來，故采用果膠酶輔助提取仙人掌總皂苷。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

果膠酶：食品級，南寧龐博生物工程有限公司；仙人掌粉：聚杰中藥有限公司；甲醇：化學(xué)純，乙醇、正丁醇、香草醛等試劑均為分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

紫外-可見分光光度計：UV-2100，北京瑞利分析儀器公司；循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-D(III)，河南省予華儀器有限公司；超級恒溫水浴及機(jī)械攪拌器：HH-501，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 實驗方法

準(zhǔn)確稱取一定量的仙人掌粉末，添加適量果膠酶、調(diào)節(jié)酶解溫度和溶液pH值提取總皂苷，提取液通過石油醚除雜，水飽和正丁醇萃取，再利用香草醛-冰醋酸顯色，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液為對照品，通過紫外-可見分光光度法測定仙人掌中總皂苷的含量。在單因素實驗(pH值、酶添加量、酶解溫度和酶解時間)的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實驗，得出仙人掌總皂苷的最佳提取條件；按照最佳提取工藝條件，進(jìn)行重復(fù)性驗證實驗，計算仙人掌總皂苷提取率[16]。

1.3 仙人掌總皂苷提取率的測定

仙人掌總皂苷提取率按如下公式計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用紫外-可見分光光度計，以齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，確定仙人掌總皂苷的最大吸收波長為547 nm，

以吸光度A為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度ρ為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)。得到回歸方程為y=19.367x+0.035 5，R2=0.994 6。說明標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度在0～0.10 mg/mL與吸光度A具有良好的線性關(guān)系。

ρ/(mg·mL-1)圖1 齊墩果酸對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2 單因素實驗結(jié)果分析

2.2.1 最佳pH值的選擇

準(zhǔn)確稱取5.00 g干燥的仙人掌粉末5份，加入0.030 g果膠酶和體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，[m(仙人掌粉末)∶V(乙醇)(g/mL，以下簡稱料液比)為1∶10，下同]，調(diào)節(jié)pH值分別為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，溫度為45 ℃，水浴酶解1.0 h后轉(zhuǎn)入95 ℃水浴加熱5 min，將提取后的溶液過濾，加入顯色劑和氧化劑并定容，研究pH值對仙人掌總皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖2。

pH圖2 不同pH值對仙人掌總皂苷提取率的影響

由圖2可見，pH值對仙人掌總皂苷的提取率有一定的影響，pH=3.5～4.5時，隨著pH值升高總皂苷的提取率也升高。當(dāng)pH>4.5時，隨著pH值升高總皂苷的提取率反而減少，pH=4.5時總皂苷的提取率最大，故最佳的提取pH=4.5。

實驗結(jié)果分析：pH值影響著仙人掌提取液中被吸附物的吸附位點(diǎn)和理化性質(zhì)，因此pH值對仙人掌中總皂苷的提取有一定程度的影響，因為仙人掌皂苷是天然弱酸性皂苷元，在弱酸性的條件下，其吸附性能好而且溶解度高。

2.2.2 最佳酶添加量的選擇

準(zhǔn)確稱取5.00 g干燥的仙人掌粉末5份，分別加入0.020、0.030、0.040、0.050、0.060 g果膠酶和料液比1∶10的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，調(diào)節(jié)pH=4.5，溫度為45 ℃，水浴酶解1.0 h后轉(zhuǎn)入95 ℃水浴加熱5 min，加入顯色劑和氧化劑并定容，研究酶添加量對仙人掌總皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖3。

m(酶)/g圖3 酶添加量對仙人掌總皂苷提取率的影響

由圖3可見，m(酶)=0.020～0.040 g時，隨著酶添加量的增加，總皂苷的提取率也隨之升高，當(dāng)m(酶)=0.040 g時，總皂苷的提取率最大，當(dāng)m(酶)>0.040 g時，總皂苷的提取率反而減少，故最佳酶添加量為0.040 g。

實驗結(jié)果分析：一定量果膠酶的加入，改變仙人掌細(xì)胞壁的通透性，使得皂苷流露出來，增加提取率，但當(dāng)繼續(xù)添加果膠酶，反而抑制酶的作用，使得提取率下降，另外果膠酶含有競爭性抑制因子，也會抑制底物與酶的結(jié)合。

2.2.3 最佳酶解溫度的選擇

準(zhǔn)確稱取5.00 g干燥的仙人掌粉末5份，加入0.030 g果膠酶和料液比1∶10的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，調(diào)節(jié)pH=4.5，溫度分別為40、45、50、55、60 ℃，水浴酶解1.0 h后轉(zhuǎn)入95 ℃水浴加熱5 min，加入顯色劑和氧化劑并定容，研究酶解溫度對仙人掌總皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖4。

酶解溫度/℃圖4 酶解溫度對仙人掌總皂苷提取率的影響

由圖4可見，當(dāng)酶解溫度在40～55 ℃時，隨著溫度的升高總皂苷的提取率也升高，當(dāng)酶解溫度升高到55 ℃時，總皂苷的提取率達(dá)到最大值，當(dāng)溫度大于55 ℃時，總皂苷的提取率反而減少，故最佳的酶解溫度為55 ℃。

實驗結(jié)果分析：酶解溫度升高可能會導(dǎo)致分子劇烈運(yùn)動，從而使分子擴(kuò)散速度加快，促使皂苷快速溶解出來，使得皂苷的提取率提高。但是如果溫度過高，就會導(dǎo)致酶的活性成分被破壞，從而導(dǎo)致仙人掌總皂苷提取率減小。

2.2.4 最佳酶解時間的選擇

準(zhǔn)確稱取5.00 g干燥的粉末5份，加入0.030 g果膠酶和料液比1∶10的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，調(diào)節(jié)pH=4.5，溫度為45 ℃，水浴酶解時間分別為1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后轉(zhuǎn)入95 ℃水浴加熱5 min，加入顯色劑和氧化劑并定容，研究酶解時間對仙人掌總皂苷提取率的影響，結(jié)果見圖5。

酶解時間/h圖5 酶解時間對仙人掌總皂苷提取率的影響

由圖5可見，酶解時間對仙人掌總皂苷的提取有一定的影響，隨著酶解時間的延長總皂苷的提取率升高，當(dāng)酶解時間達(dá)到2.5 h時，總皂苷的提取率達(dá)到最大值，而當(dāng)酶解時間繼續(xù)延長時總皂苷的提取率并沒有提高而趨于平穩(wěn)，故最佳的酶解時間為2.5 h。

實驗結(jié)果分析：隨著酶解時間的延長，仙人掌總皂苷提取率先快速增加，后趨于平穩(wěn)，原因可能是隨著時間的加長，仙人掌逐漸酶解反應(yīng)完全，所以再延長時間提取率并沒有提高。

2.3 正交實驗優(yōu)化結(jié)果分析

為進(jìn)一步優(yōu)化果膠酶解法提取仙人掌總皂苷的工藝參數(shù)，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以皂苷提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)安排正交實驗，選取pH值(A)、酶的添加量(B)、酶解溫度(C)、酶解時間(D)四個因素，正交實驗因素水平表見表1。

表1 仙人掌總皂苷提取正交實驗因素水平表

采用紫外-可見分光光度法測定總皂苷含量，通過L9(34) 正交實驗優(yōu)選出總皂苷的提取工藝，實驗分析結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果表

由表2可知，影響仙人掌中總皂苷的提取率的因素主次順序為：B>A>C>D。最佳的提取條件為B2A2C2D1，即酶添加量為0.040 g，pH=4.5，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為2.0 h。

2.4 工藝驗證實驗

稱取仙人掌粉末50.02 g，根據(jù)正交實驗得到的最佳提取工藝條件進(jìn)行驗證實驗。測得提取物中m(總皂苷)=0.091 3 g，總皂苷的提取率為0.182 5%。文獻(xiàn)報道韓本勇等人[8]直接采用乙醇提取仙人掌總皂苷，與本實驗采用果膠酶酶解法提取仙人掌總皂苷進(jìn)行對比實驗，結(jié)果見表3。表3結(jié)果表明，采用果膠酶輔助提取仙人掌中總皂苷工藝不僅可縮短提取時間，而且可有效提高總皂苷的提取率。

表3 兩種提取方法的比較

3 結(jié) 論

基于酶具有高效性和特異性，酶解法不僅可降低提取成本，提高提取率，而且安全環(huán)保。本實驗采用果膠酶輔助乙醇提取法，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交實驗，實驗結(jié)果得出果膠酶輔助提取仙人掌總皂苷的最佳提取工藝條件為m(酶)∶m(仙人掌粉末)=1∶125，pH=4.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間為2.0 h，在該條件下仙人掌中總皂苷的提取率為0.182 5%。與單純乙醇提取法相比，果膠酶輔助提取法可有效縮短提取時間，提高總皂苷的提取率。

[1] 李亞軍,賴亞輝.仙人掌的生物學(xué)功能及藥理作用研究[J].北華大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版,2007,8(3):228-231.

[2] 劉放.仙人掌的藥理作用及其開發(fā)應(yīng)用[J].浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2001,48(3):29-32.

[3] 劉健劍,何計國.超聲提取米邦塔仙人掌總皂苷的工藝優(yōu)化[J].食品科學(xué)，2010，31(16):38-41.

[4] 許世華,王桂紅,張慧勤.仙人掌提取物對小鼠血糖的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2003,38(4):543-544.

[5] 陳新梅.皂苷類脂質(zhì)體研究新進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010，19(2):20-36.

[6] 王楠，宋小駿.皂苷生物活性的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2007，20(2)：211-214.

[7] 唐青濤，馬忠華，黃苑玲，等.無患子皂苷生物活性及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007，19(B11)：562-565.

[8] 韓本勇.仙人掌總皂苷提取純化工藝的研究[D].昆明:昆明理工大學(xué)，2008.

[9] 林愛琴,方幼蘭,林曦.仙人掌皂甙化合物的提取與含量測定[J].福建師范大學(xué)學(xué)報，2003，19(4):116-120.

[10] 王穎莉,張丹丹.復(fù)合酶法提取遠(yuǎn)志總皂苷的工藝研究[J].世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2009,11(6):885-888.

[11] 張黎明,張露億,杜連祥.酶解法提取胡蘆巴種子中薯蕷皂苷元的工藝研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2005,21(2):161-164.

[12] 呂立華,周效思,彭艷梅.纖維素酶法提取知母甾體總皂苷元工藝研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報,2007,13(10):73-75.

[13] 余洪波,張曉昱.酶法在中藥提取中的研究進(jìn)展[J].中成藥,2005,27(5):591-593.

[14] 宋宏新,劉 靜,張彥娟.半仿生酶法提取三七皂苷工藝研究[J].中草藥,2009,40(6):905-907.

[15] 賴紅芳,溫曉娟.果膠酶法提取翠云草中總黃酮的工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18(23):34-36.

[16] 林碩,岳琳娜,高學(xué)玲.果膠酶提取絞股藍(lán)皂苷的工藝研究[J].中國食物與營養(yǎng),2009(4):21-24.